Оценка субпопуляционного состава моноцитов при хроническом лимфолейкозе

• Почтарь Евгений Владимирович
• Луговская Светлана Алексеевна
• Наумова Елена Владимировна
• Почтарь Маргарита Евгеньевна
• Дмитриева Елена Александровна
• Костин Александр Игоревич

Резюме

Введение. Моноциты относятся к клеткам врожденного иммунитета. Комитетом по номенклатуре Международного союза иммунологических обществ в 2010 г. одобрено разделение моноцитов на 3 субпопуляции в зависимости от экспрессии CD14 (высокоаффинный рецептор к липополисахариду) и CD16 (низкоаффинный рецептор к IgG): классические (МО1), промежуточные (МО2) и неклассические моноциты (МО3). Учитывая важную роль моноцитов-макрофагов как компонентов микроокружения клеток хронического лимфолейкоза (ХЛЛ), а также имеющиеся на сегодняшний день противоречивые данные в оценке субпопуляций моноцитов, заслуживает внимание изучение субпопуляционного состава моноцитов в зависимости от стадии ХЛЛ и проводимой терапии.

Цель работы - анализ субпопуляционного состава моноцитов в периферической крови пациентов с ХЛЛ в зависимости от стадии заболевания и проводимой терапии.

Материал и методы. Материалом для исследования служила цельная венозная кровь, стабилизированная антикоагулянтом К₂-ЭДТА. В исследование включены 30 доноров и 196 пациентов с диагнозом ХЛЛ (50 с первично выявленным, нелеченым ХЛЛ и 146 - находящихся на терапии). Для оценки субпопуляционного состава моноцитов крови использовалась панель конъюгатов моноклональных антител (МкАт), включающая CD3-FITC, CD56-PE, CD16-PE-Cy7, CD14-APC и CD45-APC-Cy7 (BD Biosciences, США, и Beckman Coulter, США). Исследования проводили на проточном цитометре FACSCanto II (BD Biosciences, США). Определяли 3 субпопуляции моноцитов: МО1 (CD14⁺⁺CD16^-), МО2 (CD14⁺⁺CD16⁺) и МО3 (CD14⁺CD16⁺⁺).

Результаты. Проведенное исследование субпопуляционного состава моноцитов крови показало, что основной субпопуляцией моноцитов периферической крови при ХЛЛ является МО1. У пациентов с ХЛЛ на терапии, не содержащей ибрутиниб, наблюдалось достоверное снижение относительного содержания МО1 по сравнению к другим обследованными группами пациентов. Также отмечалось достоверное увеличение относительного содержания МО2 во всех группах пациентов с ХЛЛ по отношению к группе доноров. Анализ относительного содержания МО3 выявил его достоверное увеличение у пациентов, находящихся на терапии, не содержащей ибрутиниб, по отношению к донорам и группам пациентов с ХЛЛ, получавшим другие схемы лечения.

Заключение. Во всех группах пациентов с ХЛЛ наблюдаются изменения субпопуляционного состава моноцитов за счет увеличения относительного содержания промежуточных форм (МО2). Снижение относительного содержания МО1 и увеличение процентного содержания МО3 отмечалось у пациентов, получающих терапию, не содержащую ибрутиниб. Анализ абсолютного содержания субпопуляций моноцитов при ХЛЛ в исследуемых группах не выявил достоверных различий.

Ключевые слова: хронический лимфолейкоз; субпопуляции моноцитов; ибрутиниб

Введение

Моноциты относятся к клеткам врожденного иммунитета, которые осуществляют важные функции в иммунопатогенезе вирусных и бактериальных инфекций, системном воспалительном ответе, развивающемся на фоне инфекционного процесса [1, 2]. Кроме того, они являются ключевыми предшественниками опухоль-ассоциированных макрофагов и дендритных клеток, формирующих микроокружение опухоли. Представляя пул эффекторных клеток врожденного иммунитета с паттерн-распознающими рецепторами, они могут выступать в качестве регуляторов опухолевого роста.

В 2010 г. международной группой экспертов, входящих в состав Международного союза иммунологических обществ (IUIS), при поддержке Всемирной организации здравоохранения была утверждена официальная номенклатура, основанная на оценке экспрессии молекул CD14 (рецептора к липополисахариду бактериальной стенки) и CD16 (компонента рецепторного комплекса к IgG), согласно которой были выделены 3 субпопуляции моноцитов: классические (МО1), промежуточные (МО2) и неклассические моноциты (МО3). Каждая субпопуляция обладает фенотипическими и функциональными особенностями (рис. 1) [3-6].

К МО1 относят субпопуляцию клеток с фенотипом CD14⁺⁺CD16^-. В норме они составляют ~ 80-85 % всей популяции моноцитов, характеризуются выраженной фагоцитарной и микробицидной активностью. При стимуляции эти клетки отличаются активным синтезом хемокинов и умеренной продукцией провоспалительных цитокинов (ФНОα, ИЛ-1β, ИЛ-10 и др.). Они первыми мигрируют в очаг воспаления, где трансформируются в воспалительные макрофаги [7].

МО2 (CD14⁺⁺CD16⁺) составляют одну из минорных субпопуляций моноцитов. Считается, что эти клетки образуются в результате активации и дифференцировки МО1 [8]. Их основные функции - умеренная фагоцитарная способность, распознавание патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (Pathogen-associated molecular patterns - PAMP), усиленный синтез провоспалительных цитокинов (ФНОα, ИЛ-1β и др.) в ответ на стимуляцию бактериальными патогенами, выраженная способность к активации T-хелперов, индукция ангиогенеза [9].

Субпопуляция МО3 (CD14⁺CD16⁺⁺) с минимальной плотностью экспрессирует CD14 и с максимальной плотностью - HLA-DR и костимуляторные молекулы. Они являются предшественниками резидентных тканевых макрофагов. Одна из основных функций МО3 - антиген-презентирующая. Активация этих клеток также приводит к синтезу и секреции цитокинов ИЛ-1 и ИФН-α при слабо выраженной способности к фагоцитозу. В исследованиях J. Skrzeczynska-Moncznik и соавт. (2008) [7] и R. Mukherjee и соавт. (2015) [8] показан высокий уровень продукции ФНОα и ИЛ-1β МО3 в ответ на стимуляцию ЛПС и S. aureus, а также низкий уровень продукции ИЛ-10.

Разделение моноцитов на субпопуляции осуществляется методом проточной цитометрии с использованием МкАт CD14 и CD16 после выделения гейта моноцитов.

При сепсисе, по данным А.А. Калашниковой и соавт. (2018) [10], увеличивается абсолютное количество моноцитов, снижается численность МО1, увеличивается относительное и абсолютное число МО2, при этом численность субпопуляции МО3 меняется незначительно.

Наибольшее число работ по оценке субпопуляционного состава моноцитов приходится на исследования инфекционных и сердечно-сосудистых заболеваний и их осложнений [11, 12]. Так, в работе K.S. Rogacev и соавт. (2012) [13] при проспективном анализе сердечно-сосудистых событий у 951 пациента, направленного на плановую коронарную ангиографию, было показано, что только увеличение субпопуляции МО2 (CD14⁺⁺CD16⁺) является независимым предиктором развития сердечно-сосудистых осложнений у данной группы пациентов.

Работы по анализу количества и субпопуляционного состава моноцитов при хроническом лимфолейкозе (ХЛЛ) малочисленны и противоречивы. Учитывая важную роль моноцитов как компонентов микроокружения клеток ХЛЛ, а также имеющиеся на сегодняшний день противоречивые данные при оценке субпопуляций моноцитов, заслуживает внимание дальнейшее изучение субпопуляционного состава моноцитов в зависимости от стадии ХЛЛ и проводимой терапии.

Материал и методы

Участники исследования. В исследование были включены 30 доноров и 196 пациентов с диагнозом ХЛЛ. Все доноры (20 мужчин и 10 женщин) в возрасте от 21 года до 54 лет (медиана - 38 лет) проходили медицинское обследование в отделении клинической, производственной трансфузиологии и гравитационной хирургии крови ГБУЗ "НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского" ДЗМ (заведующий отделением - канд. мед. наук А.И. Костин) в соответствии с приказом МЗ РФ № 1166н от 28.10.2020 "Об утверждении порядка прохождения донорами медицинского обследования и перечня медицинских противопоказаний (временных и постоянных) для сдачи крови и (или) ее компонентов и сроков отвода, которому подлежит лицо при наличии временных медицинских показаний, от донорства крови и (или) ее компонентов".

Из 196 пациентов с ХЛЛ 50 человек (27 женщин и 23 мужчин) от 48 до 84 лет были с первично выявленным, нелеченым ХЛЛ (I группа) и 146 - находящихся на различных схемах терапии. Пациентов, получающих терапию, разделили на 2 группы: II группа [116 человек; 48 женщин и 68 мужчин, медиана возраста 66 лет (от 36 до 92 лет)] - пациенты с ХЛЛ, получавших ибрутиниб-содержащие схемы лечения (ибрутиниб в виде монотерапии и в сочетании с газивой или венетоклаксом) и III группа (30 человек; 11 женщин и 19 мужчин) - пациенты с ХЛЛ, получавшие различные флюдарабин-содержащие схемы (FCR, FCR-lite). Пациенты II группы имели длительность заболевания от 1 года до 20,5 лет. Число предшествующих линий терапии (лейкеран, FCR, FCR-lite, RB, RCVP, RClb, BR, R-CHOP, преднизолон-R, GB/G, СVP/RCVP и др.) варьировало от 0 до 12 (медиана - 2,5). По длительности приема ибрутиниб-содержащих схем II группа была разделена на 2 подгруппы: группа IIa - пациенты, получавшие терапию от 8 до 24 нед (медиана - 19,0 нед) - 59 человек (23 женщины и 36 мужчин); группа IIb - пациенты с более длительной терапией (от 25 до 58 нед; медиана - 39,0 нед) - 57 человек (25 женщин и 32 мужчины). Выбор тактики терапии зависел от соматического статуса пациента и результатов клинико-лабораторных исследований.

Все пациенты проходили обследование и лечение в Московском городском гематологическом центре (МГГЦ, заведующий дневным стационаром - д-р мед. наук, проф. Е.А. Никитин) и 6-м гематологическом отделении ГБУЗ "Городская клиническая больница им. С.П. Боткина" ДЗМ (заведующий отделением - В.А. Доронин). В работе соблюдались нормы, утвержденные в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации 1964 г. До включения в исследование у всех участников было получено письменное информированное согласие на участие в исследовании и обработку персональных данных. Исследование одобрено этическим комитетом РМАНПО Минздрава России (11.12.2018).

Лабораторные исследования. Материалом для исследования служила цельная венозная кровь, стабилизированная антикоагулянтом К₂-ЭДТА. Для оценки абсолютного числа моноцитов выполняли общий анализ крови на гематологическом анализаторе ВС6800 (Mindray, Китай).

Иммунофенотипирование осуществлялось на проточном цитометре FACSCanto II (BD Biosciences, США) с использованием программного обеспечения BD FACSDiva Software version 6.1.3 с использованием многоцветной диагностической панели конъюгированных моноклональных антител (МкАт), включающей CD3-FITC, CD56-PE, CD16-PE-Cy7, CD14-APC и CD45-APC-Cy7 (BD Biosciences, США, и Beckman Coulter, США).

В ходе данного исследования определяли 3 субпопуляции моноцитов: классические моноциты (МО1 - CD14⁺⁺CD16^-), промежуточные (МО2 - CD14⁺⁺CD16⁺) и неклассические (МО3 - CD14⁺CD16⁺⁺) (рис. 2). Для этого, используя график CD45 vs SSС, выделяли популяцию лейкоцитов (гейт WBC) и моноцитов (гейт MONO) (рис. 2А). Исключали из гейта Т-лимфоциты (по CD3) и НК-клетки (по CD56). График CD14 vs CD16 строили в зависимости от гейта MONO, где выделяли гейт CD14^-CD16^- (серый цвет) (рис. 2Б). Затем на графике CD14 vs CD16 выделяли 3 популяции моноцитов с учетом исключения последнего гейта [CD14^-CD16^-] (рис. 2В).

Статистическая обработка. Статистические данные обрабатывали с использованием программы GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., США). Для каждого массива данных проводили оценку нормальности распределения с использованием критерия Колмогорова-Смирнова с поправкой Большева для группы доноров. Так как распределение данных не соответствовало нормальному закону, результаты исследования представляли в виде медианы, 10 и 90 % процентилей, а для анализа значимости различий использовались непараметрические методы. В группах непрерывных данных c независимыми выборками применяли статистический анализ с использованием теста Краскелла-Уоллиса. Для выявления взаимосвязи между двумя непрерывными переменными, не распределенными по нормальному закону, использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (ρ).

Критический уровень достоверности нулевой гипотезы принимался равным 0,05.

Результаты

При исследовании субпопуляционного состава моноцитов периферической крови анализировали относительное и абсолютное содержание субпопуляций моноцитов.

Анализ нормальности распределения содержания субпопуляций моноцитов в группах пациентов с ХЛЛ и доноров показал наличие нормального распределения данных только для относительного содержания МО1. Относительное содержание МО2 и МО3, а также абсолютное содержание МО1, МО2 и МО3 носили логнормальный характер. В связи с этим анализ относительного содержания МО1 проводили с использованием параметрических, а анализ относительного содержания МО2, МО3, а также абсолютного содержания МО1, МО2 и МО3 - непараметрических статистических методов. Результаты исследований приведены на рис. 3-5 и в табл. 1.

Проведенное исследование показало, что основной субпопуляцией моноцитов периферической крови при ХЛЛ являются МО1. У пациентов с ХЛЛ на терапии, не содержащей ибрутиниб, наблюдалось достоверное снижение относительного содержания МО1 по отношению к другим исследуемым группам (р = 0,0003; р = 0,0019; р = 0,017 и р = 0,0025 соответственно) (рис. 6А). Отмечалось достоверное увеличение относительного содержания МО2 во всех группах пациентов с ХЛЛ по отношению к группе доноров (р = 0,0234; р = 0,0051; р = 0,0061 и р = 0,0332 соответственно) (рис. 7А). Анализ относительного содержания МО3 выявил его достоверное увеличение у пациентов, находящихся на терапии, не содержащей ибрутиниб, по отношению к другим группам пациентов с ХЛЛ (р = 0,0026; р < 0,0001; р = 0,0002 и р = 0,0001 соответственно) (рис. 8А) и к группе доноров.

При оценке абсолютного содержания субпопуляций моноцитов не выявлено достоверных отличий этого показателя как между подгруппами пациентов с ХЛЛ, так и по отношению к группе доноров (рис. 6Б, 7Б, 8Б).

Обсуждение

Несмотря на то, что в литературе последних лет регистрируются многочисленные исследования субпопуляций моноцитов при различных патологиях (сердечно-сосудистые заболевания, воспалительные процессы, сахарный диабет и др.), отмечается крайне малочисленные и достаточно противоречивые сведения об изменениях субпопуляционного состава моноцитов при ХЛЛ. Так, в работе R. Maffei и соавт. (2013) [14] отмечалось значительное увеличение относительного содержания неклассических моноцитов при ХЛЛ. Однако относительное содержание МО2 было выше в группе здоровых добровольцев, а не в группе пациентов с ХЛЛ. Кроме того, в этой работе не обнаружена корреляция между относительным содержанием отдельных субпопуляций и стадией ХЛЛ, количеством лейкоцитов и экспрессией CD38 или ZAP-70, а также не выявлено связи между тремя субпопуляциями моноцитов и мутационным статусом гена IGVH.

В работе W. Kowalska и соавт. (2022) [15] отмечалось повышение относительного содержания МО3-моноцитов у пациентов с ХЛЛ, которое снижалось с прогрессированием ХЛЛ и обратно коррелировало с экспрессией прогностических факторов ZAP-70 и CD38. Более того, оно был ниже у пациентов с ХЛЛ, нуждающихся в лечении, что, по мнению автора, может указывать на благоприятное влияние МО3 на противоопухолевый ответ. В то же время в работе D. Damasceno и соавт. (2016) [16] отмечалось, что определение субпопуляций моноцитов на основе экспрессии SLAN (6-sulfo LacNAc) значительно увеличивает содержание SLAN^--МО2.

В работе Z. Mikulkova и соавт. 2021 [17] было показано, что активация циркулирующих моноцитов и Т-клеток коррелирует с количеством опухолевых клеток при ХЛЛ и применяемой терапией. Наименьшая активация моноцитов наблюдается у пациентов с прогрессирующей формой заболевания, а самая высокая активация - при индолентном течении ХЛЛ, у пациентов без лечения и пациентов, получающих терапию новыми таргетными препаратами (ибрутиниб, иделалисиб и венетоклакс).

Целью изучения субпопуляционного состава моноцитов крови стало получение данных о распределении МО1, МО2 и МО3 у пациентов с ХЛЛ. Проведенное исследование показало, что основная субпопуляция моноцитов, циркулирующих в периферической крови при ХЛЛ, представлена МО1, относительное содержание которых снижалось при использовании терапевтических схем, не содержащих ибрутиниб. Одновременно в этой же группе пациентов отмечалось увеличение относительного содержания МО3. Во всех исследуемых группах пациентов с ХЛЛ наблюдались изменения субпопуляционного состава моноцитов за счет увеличения относительного числа МО2. Однако анализ абсолютного содержания исследуемых субпопуляций моноцитов не выявил достоверных различий.

Заключение

Точный механизм изменения субпопуляционного состава моноцитов при использовании различных схем терапии ХЛЛ недостаточно изучен и требует более детального исследования с расширением спектра дифференцировочных маркеров. Мониторинг изменений абсолютного и относительного содержания субпопуляций моноцитов целесообразен для изучения фенотипической и функциональной гетерогенности этих клеток в динамике лечения пациентов с ХЛЛ.

Литература

1. Taylor P.R., Gordon S. Monocyte heterogeneity and innate immunity. Immunity. 2003; 19 (1): 2-4. DOI: https://doi.org/10.1016/s1074-7613(03)00178-x

2. Lee H.W., Choi H.J., Ha S.J., Lee K.T., Kwon Y.G. Recruitment of monocytes/macrophages in different tumor microenvironments. Biochim. Biophys. Acta. 2013; 1835 (2): 170-9. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbcan.2012.12.007

3. Ziegler-Heitbrock L., Ancuta P., Crowe S., Dalod M., Grau V., Hart D.N., Leenen P. J. M, Yong-Jun Liu, MacPherson G., Randolph G.J., Scherberich J., Schmitz J., Shortman K., Sozzani S., Strobl H., Zembala M., Austyn J.M., Lutz M.B. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 2010; 116 (16): 74-80. DOI: https://doi.org/10.1182/blood-2010-02-258558

4. Земсков В.М., Ревишвили А.Ш., Козлова М.Н., Шишкина Н.С., Куликова А.Н., Балбуцкий А.В., Алексеев А.А., Земсков А.М., Демидова В.С., Попов В.А., Плотников Г.П., Гришина Т.И., Сучков С.В., Васильев О.С., Соловьева М.С. Анализ субпопуляций моноцитов при сердечно-сосудистой, ожоговой и иной патологии (классификация 2010 г.). Медицинский совет. 2023; 17 (4): 154-63. DOI: https://doi.org/10.21518/ms2023-002

5. Савченко А.А., Мартынова Г.П., Иккес Л.А., Борисов А.Г., Кудрявцев И.В., Беленюк В.Д. Изменение субпопуляционного состава и фагоцитарной активности моноцитов у детей с инфекционным мононуклеозом при воздействии GM-CSF in vitro. Инфекция и иммунитет. 2023; 13 (3): 446-56. DOI: http://dx.doi.org/10.15789/2220-7619-CII-4666

6. Ginhoux F., Mildner A., Gautier E. L., Schlitzer A., Jakubzick C., Varol C., Bain C., Guermonprez P.. Editorial: Monocyte Heterogeneity and Function. Frontiers in Immunology. 2021; 11 (1): 5-8. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.626725

7. Skrzeczynska-Moncznik J., Browska M., Loseke S., Grage-Griebenow E., M.Zembala, Pryjma J. Peripheral blood CD14^highCD16⁺ monocytes are main producers of IL-10. Scand. J. Immunol. 2008; 67 (2): 152-9. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-3083.2007.02051.x

8. Mukherjee R., Kanti Barman P., Kumar Thatoi P., Tripathy R., Kumar Das B., Ravindran B. Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in sepsis and System Lupus Erythematous. Sci. Rep. 2015; 13886 (5). DOI: https://doi.org/10.1038/srep13886

9. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Меледина И.В., Желтова О.И., Шевела Е.Я., Останин А.А., Черных Е.Р. Субпопуляции циркулирующих моноцитов как потенциальные биомаркеры тяжести заболевания у больных вирусным циррозом печени. Инфекция и иммунитет. 2022; 12 (3): 475-85. DOI: http://dx.doi.org/10.15789/2220-7619-CMS-1810

10. Калашникова А.А., Ворошилова Т.М., Чиненова Л.В., Давыдова Н.И., Калинина Н.М. Субпопуляции моноцитов у здоровых лиц и у пациентов с сепсисом. Медицинская иммунология. 2018; 20 (6): 815-24. DOI: https://doi.org/10.15789/1563-0625-2018-6-815-824

11. Чумакова С.П., Винс М.В., Уразова О.И., Азарова Д.А., Шипулин В.М., Пряхин А.С., Букреева Е.Б., Буланова А.А., Кошель А.П., Чурина Е.Г., Ситникова А.В., Гарганеева Н.П., Новицкий В.В. Субпопуляции моноцитов крови у больных с генерализованной гипоксией. Бюлл. Сиб. Мед. 2019; 189 (1): 277-85. DOI: https://doi.org/10.20538/1682-0363-2019-1-277-285

12. Кухарчик Г.А., Лебедева О.К., Гайковая Л.Б. Моноцитарный ответ при инфаркте миокарда у пациентов с сахарным диабетом 2 типа. Российский кардиологический журнал. 2023; 28 (2): 5183. DOI: https://doi.org/10.15829/1560-4071-2023-5183

13. Rogacev K.S., Cremers B., Zawada A.M., Seiler S., Binder N., Ege P., Grobe-Dunker G., Heisel I., Hornof F., Jeken J., Rebling N.M., Ulrich C., Scheller B., Böhm M., Fliser D., Heine G.H. CD14⁺⁺CD16⁺ Monocytes independently predict cardiovascular events. Journal of the American College of Cardiology. 2012; 60 (16): 1512-20. DOI: https://doi.org/10.1038/srep13886

14. Maffei R., Bulgarelli J., Fiorcari S., Bertoncelli L., Martinelli S., Guarnotta C., Castelli I., Deaglio S., Debbia G., De Biasi S. et al. The Monocytic Population in Chronic Lymphocytic Leukemia Shows Altered Composition and Deregulation of Genes Involved in Phagocytosis and Inflammation. Haematologica. 2013; 98: 1115-23. DOI: https://doi.org/10.3324/haematol.2012.073080

15. Kowalska W., Zarobkiewicz M., Tomczak W., Wo´s J., Morawska I., Bojarska-Junak A. Reduced Percentage of CD14^dimCD16⁺SLAN⁺ Monocytes Producing TNF and IL-12 as an Immunological Sign of CLL Progression. Int. J. Mol. Sci. 2022; 23: 3029. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms23063029

16. Damasceno D., Andrés M.P., van den Bossche W.B., Flores-Montero J., de Bruin S., Teodosio C., van Dongen J.J., Orfao A., Almeida J. Expression profile of novel cell surface molecules on different subsets of human peripheral blood antigen-presenting cells. Clin. Transl. Immunol. 2016; 5: 100. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaci.2019.02.030

17. Mikulkova Z., Manukyan G., Turcsanyi P., Kudelka M., Urbanova R., Savara J., Ochodkova E., Brychtova Y., Molinsky J., Simkovic M., Starostka D., Novak J., Janca O., Dihel M., Ryznerova P., Mohammad L., Papajik T., Kriegova E. Deciphering the complex circulating immune cell microenvironment in chronic lymphocytic leukaemia using patient similarity networks. Scientific Reports. 2021; 11: 322. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-020-79121-4

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)