О роли гликолиза в продукции провоспалительных цитокинов макрофагами

Резюме

Одним из основных доказательств провоспалительной роли гликолиза служит тот факт, что конкурентный ингибитор гликолиза - 2-дезокси-D-глюкоза (2-ДГ) - подавляет продукцию различных провоспалительных цитокинов макрофагами и дендритными клетками. В настоящей работе для ингибирования гликолиза в макрофагах человека использовали как 2-ДГ, так и глюкозное голодание (культивирование клеток в среде без глюкозы). Оба подхода подавляли гликолиз одинаково эффективно. При этом глюкозное голодание в условиях нормоксии практически не влияло на экспрессию и продукцию фактора некроза опухолей (ФНО), интерлейкина-6 (ИЛ-6) и интерлейкина-1β (ИЛ-1β), индуцированную агонистами паттерн-распознающих рецепторов NOD1 и TLR4. Напротив, 2-ДГ в нормоксических условиях оказывала выраженное модулирующее действие на продукцию цитокинов (ингибирование экспрессии ФНО, ИЛ-6 и ИЛ-1β на ранних этапах активации наряду с усилением экспрессии ФНО на поздних этапах активации макрофагов). Однако эти эффекты были обусловлены не ингибированием гликолиза, а индукцией стресса эндоплазматического ретикулума. Таким образом, литературные данные о роли аэробного гликолиза в продукции провоспалительных цитокинов, полученные с использованием 2-ДГ, следует воспринимать с осторожностью. Однако в условиях гипоксии, которая в настоящей работе была смоделирована с помощью антибиотика олигомицина, гликолиз приобретает ключевое значение как для продукции цитокинов, так и для обеспечения жизнеспособности макрофагов.

Ключевые слова:макрофаги; гликолиз; 2-дезокси-D-глюкоза; мурамилпептиды; NOD1; липополисахарид; цитокины; стресс эндоплазматического ретикулума

Для цитирования: Будихина А.С., Муругина Н.Е., Максимчик П.В., Дагиль Ю.А., Николаева А.М., Балясова Л.С., Муругин В.В., Чкадуа Г.З., Пинегин Б.В., Пащенков М.В. О роли гликолиза в продукции провоспалительных цитокинов макрофагами. Иммунология. 2019; 40 (5): 11-22. doi: 10.24411/0206-4952-2019-15002.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда № 16-15-10314-П.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Введение

В настоящее время значительный интерес у иммунологов вызывает метаболизм клеток врожденной и адаптивной иммунной системы. Предполагается, что клеточный метаболизм не только обеспечивает жизнедеятельность клеток иммунной системы как таковую, но и влияет на конкретные параметры их активации и дифференцировки [1, 2].

Одной из догм в данной области является представление об аэробном гликолизе как о метаболической основе воспаления [1]. Под аэробным гликолизом понимают такой тип метаболизма, при котором, несмотря на достаточное поступление кислорода в клетку, основным источником аденозинтрифосфата (АТФ) является не окислительное фосфорилирование (ОФ), а гликолитический каскад, не требующий присутствия кислорода. Представление о провоспалительной роли аэробного гликолиза проистекает следующих данных: 1) активация макрофагов по провоспалительному M1-типу, индуцируемая интерфероном-γ (ИФН-γ) и/или липополисахаридом (ЛПС), а также активация дендритных клеток и моноцитов под действием ЛПС сопровождается значительным усилением гликолиза, которое в ряде случаев сопровождается угнетением окислительного фосфорилирования [3-6]; 2) ингибирование гликолиза в ЛПС-активированных клетках врожденной иммунной системы, как правило с помощью 2-дезокси-Э-глюкозы, приводит к подавлению продукции провоспалительных цитокинов [3, 6]; 3) первая (гипервоспалительная) стадия сепсиса характеризуется значительной интенсификацией гликолиза в лейкоцитах [7]. Предполагается, что гликолиз необходим как поставщик метаболитов и АТФ для анаболических процессов, интенсивно протекающих в активированных клетках иммунной системы, в том числе для синтеза провоспалительных цитокинов. Кроме того, некоторые ферменты гликолиза могут непосредственно регулировать экспрессию генов цитокинов [8, 9].

Тем не менее ряд данных противоречит этой основной концепции. Так, активация макрофагов по антивоспалительному M2-типу тоже характеризуется усилением гликолиза, хотя и более кратковременным, чем при M1-активации [10]. Ингибирование гликолиза в ряде случаев не влияет на продукцию провоспалительных цитокинов и даже усиливает ее [11, 12].

В большинстве работ, где сообщалось о провоспалительной роли аэробного гликолиза, в качестве ингибитора гликолиза использовали неметаболизируемый аналог D-глюкозы - 2-дезокси-Э-глюкозу (2-ДГ) [3, 6, 13-16]. 2-ДГ, как и глюкоза, проникает в цитоплазму клеток и фосфорилируется гексокиназами - группой ферментов, катализирующих первую реакцию гликолиза. В результате образуется 2-дезоксиглюкозо-6-фосфат (2-ДГ-6-фосфат). В отличие от глюкозо-6-фосфата, 2-ДГ-6-фосфат не метаболизируется следующим ферментом гликолитического каскада - глюкозо-6-фосфат-изомеразой, а, напротив, ингибирует его. Накопление 2-ДГ-6-фосфата приводит также к ингибированию гек-сокиназ по механизму отрицательной обратной связи. В результате гликолиз блокируется.

Однако в молекулярной онкологии довольно давно известен еще один вид активности 2-ДГ: ее способность вызывать стресс эндоплазматического ретикулума (ЭПР) [17, 18]. 2-ДГ химически идентична 2-дезокси-Э-маннозе: D-глюкоза и D-манноза являются эпимерами, различающимися положением атома кислорода при 2-м атоме углерода, но именно этот атом отсутствует в молекуле 2-ДГ. Вследствие этого 2-ДГ может конкурировать не только с D-глюкозой, но и с D-маннозой - углеводом, необходимым для N-гликозилирования белков в ЭПР. Нарушение N-гликозилирования белков, вызванное 2-ДГ, приводит к нарушению складывания вновь синтезируемых белков, перегрузке ЭПР этими белками и развитию так называемого ответа на несложенные белки (unfolded protein response, UPR). UPR - это сложный процесс, влияющий на различные аспекты жизнедеятельности клеток [19, 20]. В частности, при UPR существенно изменяется синтез белка, а также индуцируется ряд провоспалительных сигнальных путей [19, 20]. В работах по метаболизму клеток иммунной системы, где использовалась 2-ДГ, данный вид активности 2-ДГ практически не принимался во внимание.

В нашей предыдущей работе, посвященной метаболическому репрограммированию макрофагов человека под действием агонистов NOD-рецепторов и ЛПС, мы обнаружили, что 2-ДГ ингибирует гликолиз, но при этом оказывает двунаправленное действие на экспрессию мРНК гена фактора некроза опухолей (TNF): ингибирует ее на ранних стадиях активации макрофага (до 1 ч после добавления агонистов) и усиливает на поздних стадиях активации (4-9 ч после добавления агонистов) [21]. Аналогичные изменения наблюдались и на уровне секреции фактора некроза опухолей (ФНО). Эти изменения экспрессии ФНО было сложно объяснить, исходя только из подавления гликолиза. В настоящей работе мы использовали еще один способ ингибирования гликолиза - культивирование клеток в безглюкозной среде (глюкозное голодание). Это позволило показать, что изменения экспрессии цитокинов, наблюдаемые в присутствии 2-ДГ, обусловлены развитием UPR, а не ингибированием гликолиза. Таким образом, гликолиз, идущий в условиях нормоксии, играет существенно меньшую роль в продукции провоспалительных цитокинов, чем принято считать. Однако в условиях гипоксии, которая в данной работе была смоделирована путем ингибирования ОФ с помощью олигомицина, гликолиз оказался важен как для продукции цитокинов, так и для выживания клеток.

Материал и методы

Реактивы

Рекомбинантный гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) человека был закуплен у компании Miltenyi Biotec (ФРГ). Агонист рецептора N-ацетил-D-мурамил-L-аланил-D-изоглутамил-мезо-диаминопимелиновая кислота (М-триДАП) был закуплен у компании Invivogen (США), агонист рецептора TLR4 - ЛПС E. coli O111:B4 - у компании Merck (США). 2-ДГ, D-манноза, D-глюкоза и олигомицин производства Sigma (США). Полная культуральная среда (ПКС) представляла собой RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина и 10% фетальной телячьей сыворотки (все - Life Technologies, Великобритания). ПКС без глюкозы готовили так же, но на основе RPMI-1640, не содержащей глюкозы (Life Technologies). Содержание глюкозы в используемой фетальной сыворотке составило 2,2 мМ (0,22 мМ в ПКС без глюкозы).

Культивирование макрофагов

Культуры макрофагов получали путем 6-суточного культивирования моноцитов крови доноров с ГМ-КСФ, как описано ранее [22]. По истечении 6 сут клетки трипсинизировали, отмывали, подсчитывали и помещали в 24-луночные планшеты (SPL Life Sciences, Республика Корея) в количестве 250 тыс. клеток на лунку. Давали клеткам прикрепиться к пластику, после чего меняли среду в лунках на 500 мкл ПКС с глюкозой или без глюкозы, а также при необходимости вносили 2-ДГ (10 или 50 мМ), D-маннозу (10 или 50 мМ) и олигомицин (2 мкМ). Через 30 мин после этого в культуры добавляли М-триДАП и ЛПС до конечных концентраций 10 мкг/мл и 100 нг/мл соответственно. В лунки отрицательного контроля вместо М-триДАП или ЛПС добавляли тот же объем культуральной среды. Планшеты инкубировали при 37 °С в атмосфере 5% CO2, через необходимые промежутки времени собирали супернатанты и клеточные лизаты.

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

Экспрессию мРНК TNF, IL6,1L1B, XBP1S, XBP1U, HSPA5, E1F2AK3 и CHOP в макрофагах анализировали с помощью полимеразной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ), как было описано ранее [23]. Дизайн праймеров осуществляли с помощью онлайн-сервиса Primer-BLAST. Относительную экспрессию (ОЭ) генов рассчитывали по по методу 2-ΔΔCt. Референс-образцом, в которых ОЭ всех генов равнялась 1, служили нестимулированные клетки данного донора. В качестве нормировочного гена использовали GAPDH.

Вестерн-блоттинг

Использовали методику, описанную ранее [23]. Для определения фосфорилированных форм МАП-киназы p38 (pT180/pY182) и фактора инициации трансляции eIF2α (pS51) использовали поликлональные антитела кролика фирмы Cell Signaling Technologies (США) и вторичные антитела к иммуноглобулинам кролика, меченые пероксидазой, фирмы Jackson Immunoresearch (США). Для определения (про)интерлейкина-1β использовали козьи поликлональные антитела фирмы R&D Systems (США), вторичные биотинилированные анти-козьи антитела (Jackson Immunoresearch) и стрептавидин-пероксидазу (BD Biosciences, США). Для определения α-тубулина, служившего контролем загрузки, использовали мышиные моноклональные антитела (клон DM1A) производства Novus Biologicals (США) и вторичные антитела к IgG1 мыши, меченые пероксидазой (Jackson Immunoresearch, Великобритания).

Определение лактата и цитокинов в супернатантах клеточных культур

Концентрацию лактата в культуральных супернатантах и в ПКС определяли на биохимическом анализаторе AU480 (Beckman Coulter, США). Высвобождение лактата рассчитывали как разность концентраций в супернатанте и в ПКС. Концентрации ФНО и ИЛ-6 определяли с помощью сэндвич-ИФА, используя наборы реактивов производства eBioscience (США).

Анализ клеточного метаболизма в реальном времени

Скорость закисления внеклеточной среды (extracellular acidification rate, ECAR) и скорость потребления кислорода (oxygen consumption rate, OCR) измеряли на приборе Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent Technologies, США), как описано ранее [21]. ECAR и OCR являются показателями, соответственно, гликолиза и митохондриального дыхания. Изменения проводили в среде XF base medium (Agilent Technologies, США) с добавлением 2 мМ L-глутамина, 10 мМ D-глюкозы (Sigma, США) и 10% фетальной телячьей сыворотки. В безглюкозную среду не добавляли D-глюкозу. Конечные концентрации агонистов NOD1 и TLR4, ингибиторов гликолиза и ОФ, а также время между добавлением ингибиторов и агонистов указаны в разделе 2.2. Вычисляли площади под кривыми "время-ответ" (AUC) после добавления агонистов.

Анализ клеточной гибели

Клетки, культивированные с ингибиторами гликолиза и ОФ, отмывали и окрашивали ФИТЦ-меченым аннексином-V в аннексин-связывающем буфере (eBioscience, США). Окрашенные клетки отмывали и окрашивали пропидий-иодидом (PI) в том же буфере. Клетки анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США), определяли процентное аннексин-V+PI--клеток (апоптотических), аннексин-V+PI+-клеток (поздних апоптотических и некротических) и аннексин-V-PI--клеток (жизнеспособных).

Статистика

Все значения p получены с помощью парного t-теста. Для статистической обработки использовали программу GraphPad Instat 3.06 (GraphPad Software, США).

Результаты

2-ДГ и глюкозное голодание в равной степени ингибируют гликолиз в макрофагах

В предыдущей работе мы сообщили, что стимуляция макрофагов агонистами рецепторов NOD1 и TLR4 приводит к усилению гликолиза, что выражается в виде повышения ECAR, потребления глюкозы и высвобождения лактата [21]. В настоящей работе для ингибирования гликолиза использовали глюкозное голодание и 2-ДГ. У макрофагов, культивируемых в безглюкозной среде, базальная ECAR была снижена по сравнению с макрофагами, находящимися в обычной культуральной среде (рис. 1 А). 2-ДГ при ее добавлении в обычную ПКС с глюкозой вызывала снижение базальной ECAR до уровня, наблюдаемого в безглюкозной среде. Как 2-ДГ, так и глюкозное голодание практически полностью устраняли прирост ECAR в ответ на стимуляцию клеток М-триДАП и ЛПС (рис. 1А, Б). Кроме того, 2-ДГ и глюкозное голодание вызывали резкое снижение уровней лактата - основного продукта гликолиза - в супернатантах культур макрофагов (рис. 1В). Таким образом, 2-ДГ и глюкозное голодание подавляют гликолиз одинаково эффективно.

Глюкозное голодание практически не влияет на экспрессию генов TNF, IL6 и IL1B макрофагами активированными агонистами NOD1 и TLR4

Далее мы сравнивали, как 2-ДГ и глюкозное голодание влияет на экспрессию цитокинов, индуцированную М-триДАП и ЛПС. Как и в нашей предыдущей работе, 2-ДГ достоверно ингибировала экспрессию мРНК TNF в ранние сроки после стимуляции (1 ч), но усиливала ее в более поздние сроки (4-9 ч) (рис. 2А). Аналогичные изменения наблюдались и для секретированного ФНО: снижение уровней в ранние (3 ч) и повышение в поздние сроки (24 ч) после добавления агонистов (рис. 2Б). 2-ДГ вызывала снижение экспрессии мРНК IL6 и IL1B в ранние сроки после стимуляции (рис. 2А), а также снижение уровней ИЛ-6 в супернатанте (рис. 2В). В отличие от 2-ДГ, глюкозное голодание практически не оказывало эффекта на экспрессию и секрецию цитокинов макрофагами (рис. 2Г-Е). Ни глюкозное голодание, ни 2-ДГ существенно не влияли на жизнеспособность макрофагов за 24-часовой период культивирования (данные не показаны).

Поскольку эффект глюкозного голодания на экспрессию и продукцию цитокинов был незначителен по сравнению с эффектом 2-ДГ, мы предположили, что 2-ДГ модулирует продукцию цитокинов не через ингибирование гликолиза, а через индукцию UPR (см. Введение). Одним из характерных маркеров UPR является так называемый атипичный сплайсинг мРНК гена XBP1, кодирующего фактор транскрипции с тем же названием [24, 25]. мРНК XBP1 синтезируется конституционально в несплайсированной форме, или XBP1U (unspliced). При запуске UPR фермент IRE-1α вырезает из этой мРНК фрагмент длиной 26 нуклеотидов, что приводит к образованию сплайсированной мРНК XBP1S (spliced), с которой транслируется зрелый белок XBP1 [24]. Уже через 1,5 ч после добавления 2-ДГ (1 ч после добавления агонистов) происходило значимое повышение уровня мРНК XBP1S в макрофагах, с выходом на плато к 4 ч (рис. 3 А). Несколько позже возрастал уровень мРНК других маркеров UPR, включая XBP1U, HSPA5/ BiP, EIF2AK3/PERK и CHOP (данные не показаны). Напротив, при глюкозном голодании уровень мРНК XBP1S и других маркеров UPR достоверно не менялся (рис. 3Б). Также 2-ДГ, в отличие от глюкозного голодания, вызывала значимую активацию МАП-киназы p38 в макрофагах, что указывает на активацию провоспалительных аспектов UPR (рис. 3В, Г). Кроме того, в присутствии 2-ДГ, но не при глюкозном голодании, происходило повышение уровня фосфорилированного фактора инициации трансляции eIF2α (рис. 3Д); это событие отвечает за угнетение синтеза белка в рамках UPR. Таким образом, 2-ДГ, в отличие от глюкозного голодания, индуцирует UPR в макрофагах.

D-манноза ингибирует UPR, вызванный 2-ДГ, и ослабляет эффекты 2-ДГ на экспрессию цитокинов

UPR, индуцированный 2-дезоксиглюкозой в опухолевых клетках, ингибируется в присутствии избытка D-маннозы, которая выступает как конкурент 2-ДГ [17]. В наших экспериментах D-манноза либо полностью отменяла, либо уменьшала проявления UPR в макрофагах, включая индукцию мРНК XBP1S (рис. 4А), активацию p38 (рис. 4Б) и фосфорилирование eIF2α (данные не показаны). Также D-манноза устраняла или ослабляла влияние 2-ДГ на экспрессию мРНК TNF (рис. 4В, Д), на секрецию ФНО (рис. 4Г, Е) и в меньшей степени на экспрессию и секрецию ИЛ-6 (рис. 4Ж, З).

Интересно, что D-манноза при добавлении в безглюкозную среду в концентрациях 10 мМ и выше поддерживала гликолиз в макрофагах, что выражалось в восстановлении базальной и М-триДАП-стимулированной ECAR и высвобождения лактата (данные не показаны). Включение маннозы в гликолиз, вероятно, объясняется активностью фосфоманнозоизомеразы, преобразующей маннозо-6-фосфат во фруктозо-6-фосфат, который далее метаболизируется в гликолитическом каскаде. Однако D-манноза не отменяла ингибирующего действия 2-ДГ на гликолиз (рис. 4И, К). Таким образом, эффекты D-маннозы связаны с отменой действия 2-ДГ на N-гликозилирование белков, а не на гликолиз.

Гликолиз необходим для продукции цитокинов и поддержания жизнеспособности макрофагов в условиях гипоксии

Описанные выше эксперименты, показавшие относительно незначительную роль гликолиза в продукции цитокинов, проводили в условиях нормоксии. Вероятно, при достаточном поступлении кислорода макрофаги могут компенсировать недостаток гликолиза за счет других метаболических путей. Однако гликолиз является единственным катаболическим процессом, генерирующим АТФ независимо от ОФ, тогда как все остальные катаболические процессы, такие как β-окисление жирных кислот и глутаминолиз, являются только поставщиками электронов для ОФ, т. е. требуют поступления кислорода для генерации АТФ. Поэтому можно предположить, что в условиях гипоксии, существующей в очаге воспаления, роль гликолиза в функциях макрофагов будет более существенной. Мы смоделировали гипоксию путем добавления к макрофагам олигомицина - антибиотика, ингибирующего митохондриальную АТФ-синтазу (V комплекс дыхательной цепи). Олигомицин резко уменьшал потребление кислорода, параллельно происходило компенсаторное усиление гликолиза, выражающееся в более чем 2-кратном повышении высвобождения лактата (рис. 5А). Влияние олигомицина на гликолиз полностью ингибировалось в присутствии 2-ДГ и в безглюкозной среде (см. рис. 5А). В этих условиях происходило полное подавление продукции ФНО макрофагами в ответ на стимуляцию М-триДАП и ЛПС (рис. 5Б, В). Олигомицин, 2-ДГ и глюкозное голодание по отдельности лишь незначительно влияли на жизнеспособность макрофагов (рис. 5Г, Д). Однако при сочетанном воздействии олигомицина и ингибиторов гликолиза наблюдалось постепенное снижение доли жизнеспособных клеток, так что через 24 ч большая часть макрофагов, культивированных в данных условиях, погибала (см. рис. 5Г, Д). Таким образом, в условиях гипоксии гликолиз необходим как для продукции цитокинов макрофагами, так и для их выживания.

Обсуждение

Изучению взаимосвязи между аэробным гликолизом и продукцией провоспалительных цитокинов в последние 5-10 лет было посвящено много работ. Показано, что некоторые ферменты гликолиза могут непосредственно регулировать транскрипцию мРНК отдельных цитокинов и трансляцию соответствующих белков. Так, димеры пируваткиназы M2 (PKM2) могут поступать в ядро и усиливать ЛПС-индуцированную экспрессию мРНК IL1B и IL6 [9, 13, 26]. Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (GAPDH) в своей неактивной форме, существующей при низком поступлении глюкозы в клетку, связывается с мРНК TNF и препятствует трансляции белка ФНО; соответственно, при интенсификации гликолиза GAPDH перестает ингибировать трансляцию ФНО [8]. Рассматриваются и более общие механизмы влияния гликолиза на продукцию цитокинов, в которых гликолиз играет роль главного поставщика АТФ и исходных метаболитов для синтеза белков, включая цитокины и эффекторные молекулы. По данным многочисленных работ, ингибирование гликолиза подавляет продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами и дендритными клетками [3, 6, 13-16].

В большинстве этих работ в качестве ингибитора гликолиза использовалась 2-ДГ. При этом необходимо отметить, что описание ингибирующего действия 2-ДГ на продукцию цитокинов довольно противоречиво. Так, по данным Y.R. Na и соавт., 2-ДГ ингибирует экспрессию мРНК Il6 и Il1b в макрофагах мыши, активированных ЛПС в течение 1-4 ч [6]. Однако по данным В. Everts и соавт., 2-ДГ не влияет на экспрессию мРНК провоспалительных цитокинов при 3-часовой стимуляции ЛПС, но подавляет трансляцию этих цитокинов, что авторы этой работы объяснили вышеприведенным тезисом о роли гликолиза в поддержании синтеза белка [3]. Кроме того, хотя в большинстве работ сообщается об ингибирующем действии 2-ДГ на продукцию цитокинов [3, 6, 13, 14, 16], в некоторых работах описывается усиливающее действие 2-ДГ [11] или отсутствие эффекта [12]. Как показано в нашей работе на примере ФНО, эффекты 2-ДГ на продукцию цитокинов могут быть разнонаправленными, в зависимости от сроков активации клетки.

Мы обнаружили, что в условиях нормоксии 2-ДГ модулирует продукцию провоспалительных цитокинов через индукцию UPR, а не через ингибирование гликолиза. Способность 2-ДГ нарушать N-гликозилирование белков и тем самым вызывать UPR известна в молекулярной онкологии и рассматривается в качестве одного из подходов к усилению цитотоксичности традиционных химиотерапевтических препаратов [18]. 2-ДГ повышает экспрессию маркеров UPR в макрофагах, тогда как D-манноза, выступая в роли антагониста 2-ДГ, уменьшает проявления UPR и снижает действие 2-ДГ на экспрессию и секрецию цитокинов макрофагами. Если гликолиз ингибировали путем глюкозного голодания, то индукция маркеров UPR и изменения экспрессии цитокинов были незначительными или вовсе отсутствовали. Необходимо отметить, что при глюкозном голодании тоже возможны небольшие проявления UPR, поскольку D-глюкоза тоже необходима для N-гликозилирования белков [17].

Исходя из полученных в работе данных разнонаправленное действие 2-ДГ на экспрессию провоспалительных цитокинов может объясняться различными аспектами UPR. Так, группа процессов в рамках UPR имеет своей целью устранить перегрузку ЭПР неправильно сложенными белками. Эти процессы включают деградацию клеточной мРНК эндонуклеазой IRE-1α, а также подавление трансляции путем фосфорилирования фактора инициации трансляции EIF-2α киназой EIF2AK3 или PERKIRE-1α, и PERK являются сенсорами перегрузки ЭПР неправильно сложенными белками) [20, 27]. Указанными процессами может объясняться ингибирующее действие 2-ДГ на транскрипцию и трансляцию цитокинов, наблюдаемое в первые 1-3 ч после добавления 2-ДГ и агонистов NOD1 или TLR4. Позднее усиливающее действие 2-ДГ на экспрессию ФНО, наблюдаемое через 4 ч и позже, может объясняться активацией провоспалительных механизмов UPR. Известно, что UPR сенсибилизирует клетки к действию агонистов паттерн-распознающих рецепторов [19]. В частности, белок XBP1, транслируемый на матрице сплайсированной мРНК XBP1S, является фактором транскрипции, усиливающим экспрессию мРНК ряда цитокинов [25, 28]. МАП-киназа p38, активация которой наблюдается под действием 2-ДГ, повышает стабильность мРНК цитокинов и усиливает их трансляцию [29, 30].

Необходимо отметить, что D-манноза не полностью отменяла эффекты 2-ДГ на продукцию цитокинов, в частности ИЛ-6 (рис. 4З), поэтому мы не исключаем, что 2-ДГ в нормоксических условиях может влиять на экспрессию цитокинов иными способами, помимо индукции UPR.

Иная картина наблюдается в условиях гипоксии, когда ОФ перестает функционировать и гликолиз становится ключевым источником АТФ. Поэтому подавление гликолиза как с помощью 2-ДГ, так и путем глюкозного голодания в условиях гипоксии оказывает одинаково негативное действие как на продукцию цитокинов, так и на жизнеспособность макрофагов (см. рис. 5). В данной работе гипоксию моделировали с помощью олигомицина, однако наши предварительные данные показывают, что в условиях классической гипоксии ингибирование гликолиза оказывает аналогичное действие на выработку цитокинов и жизнеспособность.

Таким образом, работа показала, что сообщения об эффектах ингибиторов гликолиза на продукцию провоспалительных цитокинов в нормоксических условиях следует интерпретировать с осторожностью. Очевидно, что макрофаги могут компенсировать недостаток гликолиза в течение как минимум 24 ч (длительность экспериментов в данной работе), переключаясь на другие пути катаболизма, например на β-окисление жирных кислот или глутаминолиз, которые поставляют электроны в дыхательную цепь митохондрий. Если параллельно не происходит индукция UPR, ингибирование гликолиза лишь незначительно влияет на продукцию провоспалительных цитокинов. Однако в условиях гипоксии гликолиз приобретает ключевую роль как для продукции цитокинов, так и для выживания клеток врожденной иммунной системы.

Литература

1. O’Neill L.A., Pearce E.J. Immunometabolism governs dendritic cell and macrophage function. J. Exp. Med. 2015; 213 (1): 15-23.

2. Diskin C., Palsson-McDermott E.M. Metabolic modulation in macrophage effector function. Front. Immunol. 2018; 9: 270.

3. Everts B., Amiel E., Huang S.C., Smith A.M. et al. TLR-driven early glycolytic reprogramming via the kinases TBK1-IKKvarepsilon supports the anabolic demands of dendritic cell activation. Nat. Immunol. 2014; 15 (4): 323-32.

4. Everts B., Amiel E., van der Windt G.J., Freitas T.C. et al. Commitment to glycolysis sustains survival of NO-producing inflammatory dendritic cells. Blood. 2012; 120 (7): 1422-31.

5. Rodriguez-Prados J.C., Traves P.G., Cuenca J., Rico D. et al. Substrate fate in activated macrophages: a comparison between innate, classic, and alternative activation. J. Immunol. 2010; 185 (1): 605-14.

6. Na Y.R., Gu G.J., Jung D., Kim Y.W. et al. GM-CSF induces inflammatory macrophages by regulating glycolysis and lipid metabolism. J. Immunol. 2016; 197 (10): 4101-9.

7. Cheng S.C., Scicluna B.P., Arts R.J., Gresnigt M.S. et al. Broad defects in the energy metabolism of leukocytes underlie immunoparalysis in sepsis. Nat. Immunol. 2016; 17 (4): 406-13.

8. Millet P., Vachharajani V., McPhail L., Yoza B. et al. GAPDH binding to TNF-alpha mRNA contributes to posttranscriptional repression in monocytes: a novel mechanism of communication between inflammation and metabolism. J. Immunol. 2016; 196 (6): 2541-51.

9. Palsson-McDermott E.M., Curtis A.M., Goel G., Lauterbach M.A. et al. Pyruvate kinase M2 regulates Hif-1alpha activity and IL-1beta induction and is a critical determinant of the warburg effect in LPS-activated macrophages. Cell Metab. 2015; 21 (1): 65-80.

10. Huang S.C., Smith A.M., Everts B., Colonna M. et al. Metabolic reprogramming mediated by the mTORC2-IRF4 signaling axis is essential for macrophage alternative activation. Immunity. 2016; 45 (4): 817-30.

11. Miller E.S., Koebel D.A., Sonnenfeld G. The metabolic stressor 2-deoxy-D-glucose (2-DG) enhances LPS-stimulated cytokine production in mice. Brain Behav. Immun. 1993; 7 (4): 317-25.

12. Wang A., Huen S.C., Luan H.H., Yu S. et al. Opposing effects of fasting metabolism on tissue tolerance in bacterial and viral inflammation. Cell. 2016; 166 (6): 1512-25.e12.

13. Hu K., Yang Y., Lin L., Ai Q. et al. Caloric restriction mimetic 2-deoxyglucose alleviated inflammatory lung injury via suppressing nuclear pyruvate kinase m2-signal transducer and activator of transcription 3 pathway. Front. Immunol. 2018; 9: 426.

14. Dietl K., Renner K., Dettmer K., Timischl B. et al. Lactic acid and acidification inhibit TNF secretion and glycolysis of human monocytes. J. Immunol. 2010; 184 (3): 1200-9.

15. Cheng S.C., Quintin J., Cramer R.A., Shepardson K.M. et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 2014; 345 (6204): 1250684.

16. Tannahill G.M., Curtis A.M., Adamik J., Palsson-McDermott E.M. et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL-1beta through HIF-1alpha. Nature. 2013; 496 (7444): 238-42.

17. Xi H., Kurtoglu M., Lampidis T.J. The wonders of 2-deoxy-D-glucose. IUBMB Life. 2014; 66 (2): 110-21.

18. Maximchik P., Abdrakhmanov A., Inozemtseva E., Tyurin-Kuzmin P.A. et al. 2-Deoxy-D-glucose has distinct and cell line-specific effects on the survival of different cancer cells upon antitumor drug treatment. FEBS J. 2018; 285 (24): 4590-601.

19. Smith J.A. Regulation of cytokine production by the unfolded protein response; implications for infection and autoimmunity. Front. Immunol. 2018; 9: 422.

20. Grootjans J., Kaser A., Kaufman R.J., Blumberg R.S. The unfolded protein response in immunity and inflammation. Nat. Rev. Immunol. 2016; 16 (8): 469-84.

21. Муругина Н.Е., Балясова Л.С., Будихина А.С., Максимчик П.В. и др. Метаболическое репрограммирование макрофагов при их активации агонистом рецептора NOD1. Иммунология. 2019; 40 (1): 5-14.

22. Pashenkov M.V., Popilyuk S.F., Alkhazova B.I., Lvov V.L. et al. Muropeptides trigger distinct activation profiles in macrophages and dendritic cells. Int. Immunopharmacol. 2010; 10 (8): 875-82.

23. Pashenkov M.V., Balyasova L.S., Dagil Y.A., Pinegin B.V. The role of the p38-MNK-eIF4E signaling axis in TNF production downstream of the NOD1 receptor. J. Immunol. 2017; 198 (4): 1638-48.

24. Yoshida H., Matsui T., Yamamoto A., Okada T. et al. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 2001; 107 (7): 881-91.

25. Martinon F., Chen X., Lee A.H., Glimcher L.H. TLR activation of the transcription factor XBP1 regulates innate immune responses in macrophages. Nat. Immunol. 2010; 11 (5): 411-8.

26. Shirai T., Nazarewicz R.R., Wallis B.B., Yanes R.E. et al. The glycolytic enzyme PKM2 bridges metabolic and inflammatory dysfunction in coronary artery disease. J. Exp. Med. 2016; 213 (3): 337-54.

27. Hollien J., Weissman J.S. Decay of endoplasmic reticulum-localized mRNAs during the unfolded protein response. Science. 2006; 313 (5783): 104-7.

28. Kim S., Joe Y., Kim H.J., Kim Y.S. et al. Endoplasmic reticulum stress-induced IRE1alpha activation mediates cross-talk of GSK-3beta and XBP-1 to regulate inflammatory cytokine production. J. Immunol. 2015; 194 (9): 4498-506.

29. Fortin C.F., Mayer T.Z., Cloutier A., McDonald P.P. Translational control of human neutrophil responses by MNK1. J. Leukoc. Biol. 2013; 94 (4): 693-703.

30. Hitti E., Iakovleva T., Brook M., Deppenmeier S. et al. Mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 2 regulates tumor necrosis factor mRNA stability and translation mainly by altering tristetraprolin expression, stability, and binding to adenine/uridine-rich element. Mol. Cell. Biol. 2006; 26 (6): 2399-407.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»