Модельные иммуногенные конъюгированные конструкты на основе декстрана и детоксифицированного липополисахарида Shigella sonnei в качестве встроенного адъюванта

• Львов Вячеслав Леонидович
• Филатов Андрей Викторович
• Савин Андрей Павлович
• Шатилов Артем Андреевич
• Шатилова Анастасия Витальевна
• Миславский Олег Владимирович
• Вернер Ирина Карловна
• Смирнов Валерий Валерьевич
• Хаитов Муса Рахимович

Резюме

Введение. К перспективным направлениям в создании новых антибактериальных гликоконъюгатных вакцин относятся синтез и изучение протективных препаратов со встроенным адъювантом (ВА), который может выступать агонистом Toll-подобных рецепторов (TLR), локализованных на поверхности многих иммунокомпетентных клеток, в частности макрофагов и дендритных клеток. Разработка подхода к синтезу модельных конъюгированных конструктов на основе бактериального декстрана и детоксифицированного липополисахарида (д-ЛПС) открывает возможность получения эффективных профилактических и терапевтических препаратов, содержащих в своем составе полисахаридные фрагменты бактериальной природы.

Цель исследования - синтезировать конъюгаты бактериального декстрана с д-ЛПС Shigella sonnei, связь между которыми осуществляется за счет терминального остатка D-глюкозы декстрана и аминогрупп О-специфического полисахарида д-ЛПС, а также оценить уровень специфического антительного ответа на синтезированные конъюгаты в эксперименте на мышах.

Материал и методы. Высоко- и низкомолекулярные фракции д-ЛПС S. sonnei, фаза 1 получены по описанным ранее методикам с некоторыми изменениями. Каждая стадия синтеза активированных производных декстрана и конъюгатов проведена в условиях восстановительного аминирования в присутствии цианборгидрида натрия: 1) присо­единение адипиндигидразида (АДГ) к терминальному остатку D-глюкозы в декстране; 2) введение активной альдегидной группы с помощью взаимодействия АДГ-производного декстрана с глиоксалем (ГО) и 3) конъюгация активированного АДГ-ГО-декстрана с д-ЛПС S. sonnei, фаза 1. Иммуногенность полученных препаратов оценивали по продукции специфических IgG-антител у мышей в ответ на иммунизацию синтезированными конъюгатами.

Результаты. В результате взаимодействия активированного АДГ-ГО-декстрана с высоко- и низкомолекулярными фракциями д-ЛПС S. sonnei, фаза 1, с высоким выходом получены соответствующие конъюгаты, строение которых подтверждено с помощью ЯМР- и масс-спектрометрии. Показана эффективность использования ГО для создания "мостиковых" структур при синтезе конъюгированных конструктов. Проведенное исследование уровня специфических IgG к декстрану в сыворотке крови мышей показало формирование значимого иммунного ответа в результате двукратного введения полученных конъюгатов.

Заключение. Показана возможность создания иммуногенных конъюгатов со встроенным ВА нового типа. Получены модельные конструкты, в которых в качестве "слабого" иммуногена используется бактериальный декстран, а в качестве ВА - д-ЛПС S. sonnei, фаза 1. Предполагается, что в рамках этой схемы могут быть получены иммуно­генные конъюгаты, в состав которых могут входить О-специфические полисахариды, выделенные из ЛПС, бактериальные КПС, их олигосахаридные фрагменты, а также синтетичес­кие олигосахариды.

Ключевые слова: декстран; детоксифицированный липополисахарид; Shigella sonnei; встроенный адъювант

Введение

Среди антибактериальных вакцинных препаратов все более заметное место занимают вакцины, в состав которых в качестве активных субстанций входят поверхностные капсульные полисахариды (КПС) грам-положительных и грам-отрицательных микро­организмов [1, 2].

КПС, являясь факторами вирулентности, представляют собой тимус-независимые антигены, которые при использовании в качестве протективных препаратов индуцируют выработку в основном быстро исчезающих IgM-антител, но они не способны переключить гуморальный иммунный ответ на синтез долгоживущих высокоспецифичных IgG-антител и не вызывают развития В-клеточной памяти. Вакцины, в которых активным компонентом является КПС, используются только для защиты взрослых контингентов, но они не эффективны для профилактики эпидемических инфекционных заболеваний детей до 2 лет [3, 4].

В результате многочисленных исследований в моделях на животных, клинических испытаний и поствакцинальных наблюдений установлено, что значительно более высокой протективной активностью обладают конъюгированные конструкты, в которых слабоиммуногенные КПС ковалентно присоединены к адъювантной матрице, так называемому встроенному адъюванту (ВА). Наибольшее внимание уделяется созданию гликоконъюгатных вакцин со ВА, который может выступать агонистом (лигандом) Toll-подобных рецепторов (TLR), локализованных на поверхности многих иммунокомпетентных клеток, в частности макрофагов и дендритных клеток [5].

Конъюгаты, в состав которых входит иммунологически "слабый" антиген и химически связанный с ним остаток молекулы агониста TLR, способны индуцировать высокий уровень протективных IgG-антител против антигена и активировать иммунную память [6-8]. Из природных агонистов TLR4 самым мощным является высокоэндотоксичный липополисахарид грам-отрицательных микроорганизмов (ЛПС), расположенный на внешней поверхности мембраны бактериальной клетки. Будучи важнейшим фактором вирулентности грам-отрицательных бактерий, ЛПС при попадании в организм человека обычно вызывает повышение температуры тела и болезненное состояние, а в больших дозах провоцирует аномальную активность иммунной системы, сопровождающуюся мощным выбросом цитокинов - интерлейкина (ИЛ)-1β, ИЛ-6, фактора некроза опухолей α (ФНОα), что может вызвать "цитокиновый шторм" [9, 10], приводящий иногда к летальному исходу.

Недавно нами было установлено, что в результате избирательного щелочного гидролиза ЛПС могут быть получены клинически применимые препараты детоксифицированного ЛПС (д-ЛПС) Escherichia coli [11]. Этот же подход нашел применение при разработке кандидатной липополисахаридной вакцины против шигеллеза Флекснера 2а [12]. В экспериментах на животных доказаны ее безопасность и высокая иммунологическая активность, которая, в частности, выражается в индукции специфических протективных IgM-, IgG- и IgA-антител [12]. В будущем использование клинически применимых д-ЛПС в качестве иммунотропных препаратов, обладающих профилактическими и/или адъювантными характеристиками, позволило бы решить ряд проблем повышения эффективности антибактериальных вакцин [12].

Цель данной работы - синтезировать конъюгаты бактериального декстрана с д-ЛПС Shigella sonnei, связь между которыми осуществляется за счет терминального остатка D-глюкозы декстрана и аминогрупп О-специфического полисахарида д-ЛПС, а также оценить уровень специфического антительного ответа на синтезированные конъюгаты в эксперименте на мышах.

Материал и методы

Получение д-ЛПС I и д-ЛПС II проводили по описанной ранее методике [12] с незначительными изменениями. 1 г ЛПС S. sonnei, фаза 1 (содержание белка и нуклеиновых кислот < 2 %), растворили в 100 мл 0,2 М бикарбоната аммония, содержащем 1 % дезоксихолата натрия (ДХН), рН реакционной смеси довели до значения 10,2 прибавлением концентрированного водного раствора аммиака, после перемешивания в течение 16-18 ч при 50 °С к охлажденному раствору прибавили 900 мл 0,2 М раствора NaCl, содержащего 1 % ДХН. Полученный раствор подвергли последовательной тангенциальной ультрафильтрации с помощью мембран с пределом отсечения 10, 5 и 3 кДа (Владисарт, Россия). Концентрат, полученный на мембране с пределом отсечения 10 кДа, освободили от ДХН, NaCl и смеси ВЖК, образовавшейся в результате омыления исходного ЛПС, с использованием диафильтрации 0,2 М раствором NaCl и затем деионизованной водой. Выход лиофилизованного высокомолекулярного д-ЛПС I составил 290 мг.

Фильтрат, полученный при ультрафильтрации на мембране с пределом отсечения 10 кДа, далее был подвергнут ультрафильтрации на мембране с пределом отсечения 5 кДа для удаления небольшого количества промежуточной фракции д-ЛПС. Полученный таким образом фильтрат далее был подвергнут ультрафильтации на мембране с пределом отсечения 3 кДa. Выделение д-ЛПС II из образовавшегося концентрата проведено с использованием диафильтрации, как описано выше для выделения д-ЛПС I. Выход лиофилизованного низкомолекулярного д-ЛПС II составил 530 мг.

Получение активированных производных декстрана III и IV. Схема получения активированных производных декстрана III и IV приведена на рис. 2. Раствор 1 г декстрана Т5 (Pharmacia, Швеция, молекулярная масса 5 кДа) в 100 мл воды для удаления низкомолекулярных фракций подвергли ультрафильтрации с использованием мембраны с пределом отсечения 3 кДа. Полученный продукт по данным высокоэффективной хроматографии (ВЭЖХ, хроматограф Agilent Technology 1260 Infinity, (Agilent, США) с рефрактометрическим детектором, колонки TSKgel G3000PWxl (Tosoh Bioscience, Япония), 7,8 мм I.D. × 30 см, элюент 0,2М NaCl) представлял собой узкую фракцию с молекулярной массой 5-6 кДа, что было подтверждено в результате сравнительного анализа интегральных интенсивностей сигналов аномерного протона терминального остатка глюкозы на восстанавливающем конце (сигналы α-1H при 5,32 м.д., сигналы β-1H 4,74 м.д.) и остатков глюкозы внутри полисахаридной цепи (4,99 м.д.). К раствору 0,05 мМ выделенного таким образом декстрана в 30 мл 0,1 М натрий-ацетатного буфера, pH 4,5, (буфер А), прибавляли 0,5 мМ адипиндигидразида [АДГ (Sigma, Китай)] и 0,1 мМ цианборгидрида [ЦБГ (Merck, Германия)], через 16-18 ч перемешивания при 37 °С реакционную смесь наносили на колонку (90 × 2,6 см) с гелем TSK40 (элюент - вода), фракции, элюирующиеся вблизи свободного объема колонки и содержащие АДГ-производное декстрана (III) собирали, объединяли и лиофилизовали. Выход III составил 75-80 %.

К раствору 0,03 ммоля III в 20 мл буфера А прибавляли 0,3 ммоля глиоксаля [ГО (Alpha chemika, Индия), 40 % раствор] и 1 ммоля ЦБГ, через 16-18 ч перемешивания при 37 °С ГО-АДГ-производное дектрана (IV) очищали как описано для III. Выход IV составил 70-75 %.

Конъюгация активированного производного декстрана IV с д-ЛПС I и д-ЛПС II. Схема конъюгации приведена на рис. 3. Получение конъюгата д-ЛПС I с IV с помощью реакции восстановительного аминирования (РВА) проводилось при весовом соотношении I-IV 1 : 1 (молярное соотношение ~ 1 : 3) в буфере А, содержащем 1 % додецилсульфата натрия [ДСН (VWR International LLC, США)] в присутствии избытка ЦБГ при температуре 37 °С в течение 16-18 ч. Анализ реакционной смеси с помощью ВЭЖХ показал отсутствие в ней исходного IV. Реакционная смесь была подвергнута тангенциальной диафильтрации на мембране 10 кДа с использованием 0,2 М раствора хлорида натрия и далее воды до отсутствия хлор-иона. Выход конъюгата V близок к количественному.

Конъюгация д-ЛПС II с IV с помощью РВА проводилось при молярном соотношении II - IV ~ 1 : 8 (избыток IV) в буфере А, содержащем 1 % ДСН, в присутствии избытка ЦБГ при температуре 37 °С в течение 16-18 ч. Использование детергента вызвано тем, что II в 0,2 М растворе NaCl образует мицеллы, что препятствует проведению РВА. Реакционная смесь для удаления избытка IV была подвергнута препаративной гель-хроматографии на колонке с гелем TSK50 (90 × 2,6 см, элюэнт 0,2 М раствор NaCl, содержащий 1 % ДСН), фракции, содержащие конъюгат VI и элюирующиеся вблизи свободного объема колонки, объединяли, диализовали против 0,2 М раствор NaCl для удаления ДСН (диализная трубка с MWCO 3,5 кДа, Spectra/Por (Carl Roth GmbH+Co KG, Германия) затем против воды и лиофилизовали. Выход конъюгата VI близок к количественному.

Иммунизация конъюгатами V и VI. Исследование проводили на мышах линии Balb (5-6 нед, поставщик ФГБУН "Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства", филиал "Столбовая"). Мыши содержались в виварии отдела лабораторных животных ФГБУ "НМИЦ им. Н.Н. Блохина" Минздрава России на стандартном пищевом рационе брикетированных экструзированных кормов со свободным доступом к корму и питьевой воде. Все экспериментальные процедуры с животными проводили в соответствии с Правилами исследовательской работы с лабораторными животными в ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России (приказ от 12.11.2015), сертифицированными местным комитетом по этике (резолюция 4/17 от 13.07.2017).

Экспериментальные группы животных формировали методом случайной выборки с учетом массы тела в качестве ведущего показателя. В исследование были отобраны животные без признаков отклонений в состоянии здоровья (после клинического осмотра и карантина) с учетом массы тела: разброс массы тела между животными, отобранными в группы, не превышал 10 %, среднее значение массы тела статистически не различалось между группами. Масса животных к началу введения составляла 18-20 г.

Животных распределяли на 7 групп по 5 особей случайным образом. Животных иммунизировали следующими препаратами: д-ЛПС I, д-ЛПС II, декстран Т5, смесь равных количеств декстрана Т5 и д-ЛПС II (исходных соединений для синтеза конъюгата VI), конъюгат V, конъюгат VI и физиологический раствор.

Трехкратная внутрибрюшинная иммунизация была проведена в дни 0, 14, 63 эксперимента. Все препараты вводили в дозе 25 мкг/животное (за исключением смеси декстрана Т5 и д-ЛПС II, введенной в дозе 25 мкг + 25 мкг, соответственно) в объеме 500 мкл. Перед первой иммунизацией (-5 день), через 14 и 44 дня после второй иммунизации (28-й и 56-й дни) и через 14 дней после третьей иммунизации (77-й день) проводили забор образцов крови с последующим получением сывороток.

Уровень IgG-антител к декстрану в пулированных сыворотках крови мышей после иммунизации оценивали методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для этого предварительно проводили сорбцию следующих препаратов: дважды активированное производное декстрана IV, д-ЛПС I, д-ЛПС II, конъюгат V и конъюгат VI (50 мкг/мл, 100 мкл/лунку, планшеты SPL Life sciences, maxi binding, Южная Корея, в течение 3 ч при 37 °С). Сыворотку крови мышей разводили ИФА-буфером S011 ("Хема", Россия) в соотношении 1 : 100. Для детекции специфических иммуноглобулинов IgG использовали конъюгат с пероксидазой хрена поликлональных антител козы к IgG мыши ("Сорбент", Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы GraphPad Prism (версия 10.1.1 GraphPad Software, США). Статистическую значимость между выборками оценивали с помощью критерия Краскела-Уоллиса с последующим тестом Данна. Различия параметров считались статистически значимыми при p ≤ 0,05.

Результаты

Получение детоксифицированных липополисахаридов

Для получения д-ЛПС I и д-ЛПС II нативный ЛПС, выделенный из надклеточной культуральной жидкости микроорганизма S. sonnei, подвергли мягкому щелочному гидролизу. Для установления строение детоксифицированного липида А (д-ЛА) полученный д-ЛПС был подвергнут гидролизу 2 % АсОН (1 ч, 100 °С). Осадок липида А (ЛА) был анализирован с помощью электроспрей-масс-спектрометрии. Масс-спектр содержал практически единственный пик 1133,79 Дa, соответствующий триацильному производному липида А (3-Ас-ЛА). Как было установлено нами ранее [10], д-ЛПС, в состав которого входит 3-Ас-ЛА (3-Ас-ЛПС), обладает приемлемой пирогенностью (определяли в соответствии с ОФС.1.2.4.0005.15 ГФ РФ после введения в ушную вену кролика дозы, равной 0,025 мкг/мл на 1 кг массы животного) и выраженной иммуногенностью. Из полученного 3-Ас-ЛПС с помощью последовательной ультрафильтрации получили высоко- и низкомолекулярную фракции 3-Ас-ЛПС S. sonnei, препараты I и II соответственно.

Практически полное совпадение ¹Н-ЯМР-спектра I и имеющихся в литературе спектральных данных для О-специфического полисахарида (ОПС) S. sonnei, фаза 1 [13], подтверждало, что в процессе щелочного омыления не произошло структурных изменений ОПС. Сравнительный анализ интегральных интенсивностей сигналов аномерных протонов моносахаридов кора в спектре I (5,58 и 5,28 м.д., принадлежат остаткам α-D-галактопираноз) и ОПС (4,73 и 4,79 м.д., принадлежат остаткам 4-N-D-FucNAcp и L-AltNAcAp соответственно) позволил установить, что в состав I входит ОПС, содержащий не менее 30 повторяющихся олигосахаридных звеньев (ПЗ).

Для определения количества ПЗ в низкомолекулярном II он был гидролизован 2 % АсОН (1 ч, 100 °С) и полученная после удаления нерастворимого в воде 3-Ас-ЛА углеводная фракция II была очищена с помощью гель-хроматографии на колонке с гелем TSK40 (элюент - вода). Анализ полученной олигосахаридной фракции с использованием описанного выше подхода к определению количества ПЗ в ОПС, показал, что в II к олигосахариду кора присоединено в среднем 2 ПЗ. Из данных MALDI-TOF-масс-спектрометрии следовало, что при мягком кислотном гидролизе II образуется смесь олигосахаридов, в которой мажорным является олигосахарид кора с двумя ПЗ (2653 Дa), а минорными - с одним и тремя ПЗ (2250 и 3056 Дa соответственно), в смеси присутствовало также заметное количество олигосахарида кора, не содержащего ПЗ (1847 Дa). Полученные данные соответствуют опубликованным ранее [13]. Строение высокомолекулярного I (n ≈ 30) и низкомолекулярного II (n = 0, 1) представлено на рис. 1.

Получение активированных производных декстрана III и IV

Активированное производное декстрана III получено в результате взаимодействия декстрана с остатком D-глюкозы в ациклической форме на восстанавливающем конце с избытком АДГ в присутствии ЦБГ в ацетатном буфере рН 4,5 с последующим обессоливанием с помощью гель-хроматографии. Наличие в составе III остатка АДГ подтверждено данными ¹Н-ЯМР-спектрометрии: спектр III содержал характерные сигналы четырех метиленовых звеньев, принадлежащих остатку АДГ при 1,54 м.д. (4Н) и 2,17 м.д. (4Н). Аналогичным образом было проведено получение IV взаимодействием III с избытком ГО. В ¹Н-ЯМР спектре IV наряду с сигналами четырех метиленовых звеньев (1,58 м.д., 4Н; 2,22 м.д., 4Н), принадлежащих остатку АДГ, наблюдался сигнал метиленового звена фрагмента -NHNHCH₂CHO (хим. сдвиг 1,89 м.д.) - продукта восстановления ЦБГ образовавшегося на промежуточном этапе фрагмента -NHN=CHCHO (рис. 2).

Получение конъюгатов V и VI

Конъюгаты V и VI получены в результате взаимодействия активированного производного декстрана IV c д-ЛПС I и д-ЛПС II в условиях РВА. Спектр конъюгата V включает характерный сигнал аномерного протона декстранового фрагмента (5,02 м.д., дублет 1Н), сигналы протонов модифицированных остатков АДГ и ГО ("мостик") и сигналы протонов моносахаридов, входящих в состав ОПС (рис. 3).

Строение VI (рис. 3.) подтверждено данными ¹Н-ЯМР, съемка которого проводилась при повышенной температуре (ТЕ = 323К), так как при более низких температурах VI в D₂O образует мицеллы, в которых остатки ВЖК и частично фрагменты олигосахарида кора ПЗ локализуются во внутренних областях мицеллы. Это препятствует обнаружению как минорных сигналов, принадлежащих "мостиковому" фрагменту (АДГ-ГО), аномерных сигналов моно­сахаридов ПЗ и олигосахарида кора, так и мажорных сигналов остатков ВЖК и Ме- и АсNH-групп моносахаридов ПЗ. В ¹Н-ЯМР спектре VI идентифицированы характерные сигналы остатка декстрана (сигнал аномерного протона при 4,94 м.д.), "мостикового" фрагмента (сигналы остатка АДГ при 1,59 м.д., 4Н и 2,23 м.д., 4Н; сигналы этиленового остатка (образовался из ГО в результате восстановительного аминирования) при 2,91 м.д., 4Н) и остатка II (сигналы остатков ВЖК при 0,84 м.д. и 1,26 м.д.; характерные сигналы аномерных протонов двух остатков α-D-галактопираноз олигосахарида кора при 5,58 м.д. и 5,28 м.д.; сигнал 6-дезоксигруппы остатка 4-N-D-FucNAcp при 1,31 м.д., сигналы N-ацетильных групп остатков 4-N-D-FucNAcp и L-AltNAcAp в области 2,0 м.д., также их аномерных протонов при 4,79 м.д. и 4,88 м.д., соответственно).

Результаты иммунизации мышей конъюгатами V и VI

Для проведения ИФА иммунных сывороток мышей использовали планшеты, сорбированные д-ЛПС I и д-ЛПС II, дважды активированным производным декстрана IV (нами установлено, что дважды активированное производное декстрана IV, в отличие от исходного гидрофильного декстрана, сорбируется на планшет в стандартных условиях) и конъюгатами V и VI. Анализ сывороток, полученных в результате иммунизации декстраном или смесью декстран + д-ЛПС II, показал отсутствие заметного количества антител к декстрану. В сыворотках мышей, иммунизированных д-ЛПС I и д-ЛПС II, а также конъюгатами V и VI, в состав которых они входят, обнаружен высокий уровень IgG-антител к соответствующим д-ЛПС.

Ответ на вопрос, индуцируют ли конъюгаты V и VI образование IgG-антител к декстрановому компоненту конъюгатов, был получен в результате ИФА соответствующих иммунных сывороток. Для этого на планшетах сорбировано дважды активированное производное декстрана IV и использованы иммунные сыворотки против конъюгатов V и VI. Проведенное исследование уровня IgG-антител к декстрану в сыворотке крови мышей показало формирование заметного иммунного ответа на 56-й день опыта. Через 2 нед после третьей иммунизации (77-й день опыта) наблюдалось значительное увеличение уровня специфических IgG-антител (рис. 4, 5).

Обсуждение

В последние десятилетия заметное место среди антибактериальных вакцин занимают полисахарид-белковые конъюгаты (ПБК). Присоединение к бактериальному КПС белкового носителя (обычно анатоксина) обеспечивает ПБК статус тимус-зависимого иммуногена и, таким образом, позволяет активировать иммунную память. Однако этот подход, несмотря на ряд несомненных достоинств, не лишен некоторых существенных недостатков. При использовании ПБК в силу их невысокой иммуногенности обычно требуется двух- или трехкратная вакцинация. Значительное содержание в ПБК белкового компонента (> 50 %) приводит к индукции мощного экранирующего антибелкового ответа. При конъюгации КПС с белком на первом этапе обычно проводится "рандомная" активация КПС-компонента с последующим образованием "мостиковых" связей с белковым носителем, число которых зачастую с трудом поддается регулированию и контролю. Кроме того, наличие в ПБК нескольких точек связывания между КПС и белком приводит к появлению новых структурных эпитопов в полисахаридной (и белковой) цепи и, как следствие, к индукции антител, не характерных для иммунного ответа на нативный КПС (и белок). Относительно высокая стоимость ПБК также существенно влияет на масштаб применения вакцин на их основе. Таким образом, проблема поиска подходов к разработке новых антибактериальных вакцин на основе поли- и олигосахаридных конструктов не теряет актуальности. Одним из таких подходов представляется введение в конъюгат вместо белковой матрицы д-ЛПС - агониста TLR4 в качестве ВА.

ЛПС, называемый также эндотоксином грам-отрицательных микроорганизмов, локализован на поверхности внешней мембраны клеточной стенки и представляет собой комбинацию нескольких типов биополимеров, близких по структуре, но отличающихся по молекулярной массе. Полноценные S-ЛПС, характерные для S-форм бактерий (образуют при культивировании на твердой питательной среде гладкие - smooth - колонии), содержат 3 структурно различающихся фрагмента: ОПС, олигосахарид кора и ЛА (рис. 5). ОПС включает от 1 до 20-30 одинаковых ПЗ.

Структура ОПС, уникальная для каждого микроорганизма, обусловливает специфичность антительного ответа при появлении ЛПС в организме теплокровных. Моносахарид на восстанавливающем конце ОПС присоединяется к олигосахариду кора (10-12 моносахаридов), структура которого сходна у бактерий одного рода. Олигосахарид кора, в свою очередь, присоединяется к ЛА - гидрофобному компоненту ЛПС, представляющему собой фосфорилированный при С1 и С4' дисахарид β-D-глюкозаминил-(1-6)-β-D-глюкозамин, который несет от 4 до 7 остатков высших жирных кислот (ВЖК). ЛА-фрагмент является триггером активации иммунной системы организма хозяина посредством прямого взаимодействия с TLR4 и определяет все эндотоксические характеристики ЛПС.

ЛА, при наличии которого ЛПС обладает максимально высокой иммунологической (и эндотоксичес­кой) активностью, обычно содержит 2 фосфатные группировки при С1 и С4' и 6 остатков ВЖК, причем непосредственно с НО- и Н₂N-группами дисахарида связаны 4 остатка β-гидроксимиристиновой кислоты, 2 из них О-ацилированы ВЖК с числом атомов углерода от 12 до 18. ЛПС как патогенных, так и непатогенных микроорганизмов, в состав которого входит ЛА со структурой, отличной от описанной выше, характеризуются существенно более низким уровнем иммунологической активности и эндотоксичности.

Эти отличия касаются: а) строения ВЖК и/или их числа; б) наличия заместителей в остатках фосфорной кислоты и/или отсутствии фосфата при С1; в) замены D-глюкозамина в базовом дисахариде на другой аминосахар [14]. ЛПС с такой "неклассической" структурой ЛА способен обеспечивать защиту микроорганизма от некоторых иммунных механизмов организма хозяина, в частности, являясь антагонистом TLR4, избегать активации системы врожденного иммунитета.

Исследования, направленные на получение из природных эндотоксичных ЛПС клинически применимых д-ЛПС для использования их в качестве иммунотропных препаратов, до недавнего времени не были успешны. Химические и генно-инженерные трансформации эндотоксичных ЛПС приводили к продуктам с экстремально высокой эндотоксичностью или неприемлемо низкой иммуногенностью. Однако в последние годы с использованием различных подходов к химической модификации остатка ЛА эндотоксичных ЛПС удалось получить ряд эффективных кандидатных вакцинных препаратов на основе д-ЛПС [12]. Другим перспективным направлением использования ЛПС является получение из них детоксифицированных д-ЛА, которые находят применение в качестве адъювантов для некоторых вакцин [15].

В настоящее время известно несколько клинически применимых адъювантов липидной природы, получаемых из эндотоксичных ЛПС в результате химичес­кой обработки. Наиболее широко применяется, как адъювантная добавка к вакцинам, монофосфорил-липид А, который содержит 6 остатков ВЖК, характерных для эндотоксичных ЛПС, но лишен фосфата при С1 [14, 16, 17]. Использование д-ЛА в качестве ВА осложнено отсутствием в их молекулах химически активных групп, при наличии которых возможно создание ковалентной связи со "слабым" поли- или олигосахаридным антигеном. Синтез аналогов природных д-ЛА, которые могли бы быть использованы в качестве ВА для синтеза ПС-ВА-конструктов, многостадиен и дорогостоящ. Недавно нами была показана возможность получения из эндотоксичных ЛПС иммуногенных клинически применимых 3-Ас-ЛПС [12]. В рамках настоящего исследования получен 3-Ас-д-ЛПС S. sonnei, фаза 1, цвиттерионный ОПС которого несет активные Н₂N- и НООС-группы и, таким образом, может быть использован в качестве ВА для синтеза ПС-ВА-конъюгированных препаратов. Высоко- и низкомолекулярная фракции 3Ас-д-ЛПС (I и II, соответственно) были использованы нами в качестве ВА для конъюгации с активированным производным модельного неиммуногенного декстрана (см. рис. 3). Установлено, что полученные таким образом конъюгаты после двукратной иммунизации мышей индуцируют выраженный IgG-ответ на декстрановый фрагмент конъюгата.

Начиная с 1990-х гг. время от времени появляются публикации, в которых описывается синтез декстран-белковых конъюгатов, однако высокомолекулярный декстран выступает в них в роли матрицы для повышения уровня иммунного ответа на слабый антиген - белок. Лишь в одной из публикаций [18] рассматривается вопрос об иммунном ответе на декстран в составе конъюгата. Установлено, что иммунизация конъюгатом декстран-белок приводит к индукции лишь IgM-антител против декстрана, причем их титр не увеличивается после вторичной иммунизации.

Предлагаемый подход, включающий синтез полисахарид-липополисахаридных конъюгатов, может быть использован для получения других типов конъюгированных конструктов. Так, известны патогенные микроорганизмы, вакцины против которых востребованы, но их ЛПС в силу структурных особенностей являются антагонистами TLR4, что позволяет этим микроорганизмам с низкоиммуногенным ЛПС избегать обнаружения иммунной системой организма хозяина. Одним из решений проблемы разработки вакцин против таких бактериальных патогенов может стать разработка конъюгированных протективных препаратов, в которых ОПС, выделенный из низкоиммуногенных ЛПС, ковалентно присоединяется к ВА, который представляет собой д-ЛПС. Аналогичный подход, очевидно, может быть применен для синтеза конъюгатов, в которых д-ЛПС связан ковалентной связью с другими антигенами углеводной природы: бактериальными КПС, олигосахаридными фрагментами ОПС и КПС или их синтетическими аналогами. Так как в состав ВА может входить более одного химически активного центра, возможно присоединение к ВА нескольких антигенных полисахаридных цепей, что позволяет синтезировать аналоги природных ЛПС различной архитектоники.

Заключение

С использованием модельных конъюгатов, в состав которых в качестве антигена входит бактериальный неиммуногенный декстран, а в качестве ВА - 3Ас-д-ЛПС S. sonnei, фаза 1, показана возможность создания иммуногенных конъюгированных конструктов нового типа. В роли слабых полисахаридных иммуногенов могут быть использованы ОПС, выделенные из ЛПС, бактериальные КПС, их олигосахаридные фрагменты, а также синтетические олигосахариды - аналоги природных. Установлено, что использование глиоксаля в качестве сшивающего агента вместо обычно используемого глутарового альдегида позволяет эффективно проводить активацию аминогрупп в условиях РВА без образования побочных продуктов и однозначно доказывать строение полученных производных.

Литература

1. Львов В.Л., Вернер И.К., Гущин В.А., Васина Д.В., Антонова Н.П., Григорьев И.В. Способ получения капсульных полисахаридов Streptococcus pneumoniae вакцинного качества, свободных от примеси С-полисахарида. Иммунология. 2024; 45 (6): 766-76. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-6-766-776

2. Lee C.J., Lee L.H., Lu C.S., Wu A. Bacterial polysaccharides as vaccines - immunity and chemical characterization. Review. Adv. Exp. Med. Biol. 2001; 491: 453-71. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-4615-1267-7_30

3. Авдеев С.Н., Алыева М.Х., Баранов А.А., Бикмиева А.В., Брико Н.И., Булгакова В.А., Вишнева Е.А., Горелов А.В., Демко И.В., Добрынина Е.А., Драпкина О.М., Жданов К.В., Жестков А.В., Зайцев А.А., Игнатова Г.Л., Козлов Р.С., Коршунов В.А., КостиновК М.П., Куличенко Т.В., Лобзин Ю.В., Мазанкова Л.Н., Намазова-Баранова Л.С., Полибин Р.В., Ртищев А.Ю., Селимзянова Л.Р., Сидоренко С.В., Таточенко В.К., Ткачева О.Н., Федосеенко М.В., Фельдблюм И.В., Харит С.М., Чуланов В.П., Шубин И.В. Вакцинопрофилактика пневмококковой инфекции у детей и взрослых. Методические рекомендации. Профилактическая медицина. 2023; 26 (9): 3-23. DOI: https://doi.org/10.17116/profmed2023260923

4. Иммунопрофилактика менингококковой инфекции у детей. Руководства по профилактике заболевания/синдромов. Министерство здравоохранения Российской Федерации. 2017.

5. Qingjiang L., Zhongwu G. Recent advances in Toll like receptor-targeting glycoconjugate vaccines. Molecules. 2018; 23 (7): 1583-607. DOI: https://doi.org/10.3390/molecules23071583

6. Coffman R.L., Sher A., Seder R.A. Vaccine adjuvants: putting innate immunity to work. Immunity. 2010; 33: 492-503. DOI: https://doi.org/10.1016/j.immuni.2010.10.002

7. Awate S., Babiuk L.A., Mutwiri G. Mechanisms of action of adjuvants. Front. Immunol. 2013; 4: 114-24. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2013.00114

8. Avci F.Y., Kasper D.L. How bacterial carbohydrates influence the adaptive immune system. Annu. Rev. Immunol. 2010; 28: 107-30. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev-immunol-030409-101159

9. Jarczak D., Nierhaus A. Cytokine storm-definition, causes, and implications affiliations. Int. J. Mol. Sci. 2022; 23 (19): 11740-70. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms231911740

10. Ohto U., Fukase K., Miyake K., Shimizu T. Structural basis of species-specific endotoxin sensing by innate immune receptor TLR4/MD-2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012; 109 (19): 7421-6. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1201193109

11. Dyatlov I.A., Svetoch E.A., Mironenko A.A., Eruslanov B.V., Firstova V.V., Fursova N.K., Kovalchuk A.L., Lvov V.L., Aparin P.G. Mole­cular lipopolysaccharide di-vaccine protects from Shiga-toxin producing epidemic strains of Escherichia coli O157:H7 AND O104:H4. Vaccines. 2022; 10 (11): 1854-71. DOI: https://doi.org/10.3390/vaccines10111854

12. Ledov V.A., Golovina M.E., Alkhazova B.I., Lvov V.L., Kovalchuk A.L., Aparin P.G. A pentavalent Shigella Flexneri LPS-based vaccine candidate is safe and immunogenic in animal models. Vaccines (Basel). 2023; 11 (2): 345-60. DOI: https://doi.org/10.3390/vaccines11020345

13. Robbins J.B., Kubler-Kielb J., Vinogradov E., Mocca C., Pozsgay V., Shiloach J., Schneerson R. Synthesis, characterization, and immunogenicity in mice of Shigella sonnei O-specific ligosaccharide-core-protein conjugates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106 (19): 7974-8. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.0900891106

14. Molinaro A., Holst O., Di Lorenzo F., Callaghan M., Nurisso A., D’Errico G., Zamyatina A., Peri F., Berisio R., Jerala R., Jimenez-Barbero J., Silipo A., Martin-Santamaria S. Chemistry of lipid A: at the heart of innate immunity. Chemistry. 2015; 21 (2): 500-19. DOI: https://doi.org/10.1002/chem.201403923

15. Casella C.R., Mitchell T.C. Putting endotoxin to work for us: Monophosphoryl lipid A as a safe and effective vaccine adjuvant. Cell Mol. Life Sci. 2008; 65 (20): 3231-40. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-008-8228-6

16. Raetz C.R.H, Reynolds C.M., Trent M.S., Bishop R.E. Lipid A modification systems in gram-negative bacteria. Annu. Rev. Biochem. 2007; 76: 295-329. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.biochem.76.010307.145803

17. Raetz C.R.H., Whitfield C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 2002; 71: 635-700. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.biochem.71.110601.135414

18. Sarkar A.K., Das M.K. Production of antibodies to dextran using liposome as adjuvant. 1991; 20 (3): 243-52. DOI: https://doi.org/10.3109/08820139109026227

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)