Влияние детоксицированного липополисахарида Shigella sonnei на метастазирование клеток меланомы В16

• Новикова Елена Михайловна
• Чухина Елена Станиславовна
• Разваляева Надежда Алексеевна
• Козырева Ольга Валентиновна
• Степаненко Родион Николаевич

Резюме

Введение. Согласно существующим в настоящее время представлениям, метастазирование представляет собой результат сложного многоступенчатого процесса, который определяется взаимодействием между метастатическими клетками, опухолевым микроокружением и гомеостатическими механизмами. Большую роль в прогрессии и метастазировании меланомы играют поверхностные рецепторы, представленные на клетках опухоли. В первую очередь это относится к Толл-подобным рецепторам (Toll-like receptors, TLRs). Среди TLRs, экспрессируемых малигнизированными меланоцитами, присутствует TLR4. Это один из важнейших представителей семейства TLRs, высокая экспрессия которого на опухолевых клетках и клетках опухолевого микроокружения при различных типах рака тесно коррелирует с началом онкогенеза, прогрессированием опухоли и лекарственной устойчивостью. С другой стороны, имеются данные о подавлении роста опухоли после стимуляции липополисахаридом (ЛПС) клеток меланомы, экспрессирующих TLR4. В то же время, как было показано в ряде работ, при культивировании опухолевых клеток in vitro с детоксицированными агонистами TLRs увеличивается количество клеток, экспрессирующих TLR4, что может оказывать существенное влияние на прогрессирование опухоли и метастазирование при последующем введении этих клеток экспериментальным животным.

Наряду с TLR4 на поверхности клеток меланомы присутствует еще ряд антигенов (Аг), изменение экспрессии которых может оказывать существенное влияние на способность опухолевых клеток к метастазированию. К ним относятся рецептор хемокина CXCR4 (CD184), интегрины, рецептор для гиалуроновой кислоты (CD44) и маркер опухолевых стволовых клеток - белок CD24.

Цель исследования - изучение воздействия in vitro детоксицированного липополисахарида (Ас3-S-ЛПС) Shigella sonnei, фаза 1, на метастазирование и экспрессию клетками меланомы В16 TLR4, рецептора хемокина CXCR4 (CD184), интегрина αvβ5, рецептора для гиалуроновой кислоты (CD44), маркера опухолевых стволовых клеток - белка CD24 и белка PD-L1 (CD274) (лиганда рецептора программируемой клеточной смерти - PD-1) и MHC I.

Материал и методы. Клетки меланомы линии В16 культивировали с различными концентрациями Ас3-S-ЛПС в течение 48 ч при 37 °С в СО₂-инкубаторе и после окончания культивирования вводили внутривенно мышам линии С57Bl/6. На 21-е сутки после инокуляции опухолевых клеток животных забивали и подсчитывали количество метастазов в легких. Для определения влияния Ас3-S-ЛПС на экспрессию поверхностных Аг: хемокина CXCR4, рецептора для гиалуроновой кислоты, маркера опухолевых стволовых клеток, MHC I и белка PD-L1 клетки культивировали, а затем окрашивали моноклональными антителами (Ат), конъюгированными с флуоресцирующими красителями. Пробы анализировали на проточном цитометре. Для оценки экспрессии TLR4 и интегрина αvβ5 опухолевые клетки после культивирования с Ас3-S-ЛПС окрашивали первичными рекомбинантными поликлональными Ат к TLR4, затем вторичными Ат - антикроличьим IgG (H+L) фрагментом F(ab')2, конъюгированным с Alexa Fluor 488, и анализировали клеточные препараты под флуоресцентным микроскопом.

Результаты. Полученные результаты свидетельствуют о том, что культивирование опухолевых клеток с агонистом TLR4 (Ас3-S-ЛПС) приводит к снижению их метастатического потенциала, увеличивает количество клеток, экспрессирующих TLR4 и несущих рецептор для гиалуроновой кислоты (CD44), и снижает количество клеток, несущих CXCR4 (CD184). При этом количество клеток, экспрессирующих маркер опухолевых стволовых клеток (CD24) и интегрин αvβ5, практически не изменилось. Для образования метастазов в легких большое значение имеет присутствие на опухолевых клетках рецептора CXCR4. Изучено влияние культивирования опухолевых клеток с Ac3-S-ЛПС на экспрессию CXCR4 на клетках, несущих CD44, CD24 и PD-L1 (CD274). Установлено, что культивирование в течение 48 ч клеток меланомы линии В16 с Ac3-S-ЛПС привело к снижению количества клеток, экспрессирующих CD184⁺/CD44⁺, и практически не оказало влияния на количество клеток, несущих CD184⁺/CD24⁺ и CD184⁺/CD274⁺. В то же время культивирование опухолевых клеток с Ас3-S-ЛПС привело к увеличению в популяции количества малигнизированных меланоцитов, экспрессирующих белки MHC I и PD-L1.

Заключение. Культивирование клеток меланомы линии В16 с детоксицированным ЛПС Shigella sonnei, фаза 1, приводит к снижению метастатического потенциала опухолевых клеток. Этот эффект обусловлен снижением под влиянием Ас3-S-ЛПС количества клеток, несущих CXCR4. И хотя после культивирования с агонистом количество клеток, несущих CD44⁺, увеличивается, что значительно облегчает эмиграцию клеток из первичных опухолевых узлов, отсутствие на них рецептора CXCR4 не позволяет им локализоваться в легочной ткани.

Ключевые слова: меланома В16; малигнизированные клетки; детоксицированный липополисахарид; TLR4; CXCR4; CD44

Введение

Согласно существующим в настоящее время представлениям, метастазирование представляет собой результат сложного многоступенчатого процесса, который определяется взаимодействием между метастатическими клетками, опухолевым микроокружением и гомеостатическими механизмами. Микроокружение опухоли, которое включает фибробласты, кератиноциты, иммунные клетки, различные растворимые факторы и внеклеточный матрикс, оказывает значительное влияние на рост, локальную инвазию и метастатическое распространение малигнизированных клеток [1]. Иммунные клетки микроокружения опухоли, представленные цитотоксическими CD8⁺-T-лимфоцитами, эффекторными CD4⁺-Т-лимфоцитами, естественными киллерами, дендритными клетками, М1-поляризованными макрофагами и рядом других, играют ключевую роль в развитии противоопухолевого иммунного ответа [2, 3]. Взаимодействие между иммунной системой и злокачественными клетками в конечном итоге влияет на прогрессию и метастазирование опухоли.

Считается, что в основе диссеминации опухоли из первичного источника в жизненно важные органы лежит эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) - процесс, при котором эпителиальные клетки, образующие опухоль на начальных этапах ее развития, трансформируются в мезенхимальные, обладающие высокой подвижностью и способностью к миграции [4]. При этом провоспалительные процессы, инициируемые развитием опухоли, сопровождаются синтезом различных цитокинов, способствуют развитию злокачественных новообразований и являются одной из причин метастатического процесса. К медиаторам воспаления, которые способствуют ЭПМ, относятся ТФРβ, ИЛ-1β, ФНО, ИЛ-10 и ИЛ-6 и ряд других [5].

Установлено, что большую роль в прогрессии, адгезии и метастазировании меланомы играют поверхностные рецепторы, представленные на клетках опухоли. В первую очередь это относится к Толл-подобным рецепторам (TLR). Показано, что клетки меланомы экспрессируют в большом количестве TLR2, TLR3 и TLR4 и гораздо меньшем - TLR1, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 и TLR10. При этом экспрессия TLR на клетках различных линий меланомы может значительно различаться [6]. Взаимодействие TLR клеток меланомы с соответствующими лигандами приводит к синтезу ФНОα, ИЛ-1, ИЛ-6, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), хемокинов CCL2 и CXCL10, ИЛ-10 и циклогеназы-2. Ранее нами было также показано, что культивирование клеток меланомы В16 с агонистом TLR4 (Ас3-S-ЛПС) приводит к появлению в супернатанте культур ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-10 [7].

Среди TLR, экспрессируемых малигнизированными меланоцитами, присутствует TLR4 - один из важнейших представителей семейства Толл-подобных рецепторов, который играет существенную роль в развитии многих воспалительных заболеваний. При этом клетки меланомы, нокаутированные по TLR4, утрачивают способность к метастазированию в легкие, а ЛПС (лиганд TLR4), может усиливать пролиферацию и миграцию TLR4⁺-клеток меланомы, но не TLR4^--клеток [8]. Все больше и больше данных свидетельствуют о том, что высокая экспрессия этого рецептора на опухолевых клетках и клетках опухолевого микроокружения при различных типах рака тесно коррелирует с началом онкогенеза, прогрессированием опухоли и лекарственной устойчивостью [9].

Установлено, что TLR4, представленный на опухолевых клетках, может быть активирован как бактериальными эндотоксинами, так и множеством эндогенных лигандов [10]. При этом в зависимости от микроокружения и стадии заболевания активация TLR4 может либо стимулировать [11], либо ингибировать развитие опухоли [12]. Cтимуляция ЭМП и усиление метастазирования в результате взаимодействия TLR4 с агонистами микробного происхождения обусловлена присутствием в молекуле липополисахаридов грам-отрицательных бактерий эндотоксина (липида А) [13]. В экспериментах с использованием клеток опухолей меланомы человека было показано, что лиганды TLR4 активируют STAT3 через MYD88 (ген первичной реакции миелоидной дифференцировки 88) и TRIF (TIR-домен, содержащий адаптор, индуцирующий ИФН-β) в клетках меланомы и способствуют STAT3-опосредованным клеточным реакциям при прогрессировании меланомы. Стимуляция ЛПС TLR4 усиливает активацию STAT3 в тканях меланомы и способствует росту опухоли, ангиогенезу и ЭМП [14-16].

В то же время в литературе имеются данные о подавлении роста опухоли после стимуляции клеток меланомы, экспрессирующих TLR4, ЛПС E. coli. Так, активация передачи сигналов TLR4 в клетках двух различных линий опухолевых клеток in vitro подавляет рост опухоли in vivo. Этот эффект не обусловлен действием ЛПС на пролиферацию/апоптоз опухолевых клеток. Авторы полагают, что взаимодействие ЛПС с TLR4 опухолевых клеток in vitro индуцирует образование провоспалительных медиаторов, которые могут существенно изменить опухолевое микроокружение при дальнейшем введении этих клеток invivo, изменяя тип иммунного ответа против опухоли [17].

Цель нашего исследования - оценить влияние культивирования клеток меланомы В16 с агонистом рецептора TLR4 на способность этих клеток образовывать метастазы в легких после введения экспериментальным животным. В качестве агониста TLR4 мы использовали детоксицированный ЛПС штамма Shigella sonnei, фаза 1. Данный ЛПС состоит из длинной О-специфической полисахаридной цепи (О-антиген), ковалентно связанной с три-ацилированным липидом А, содержащим 3, а не 6 остатков высших жирных кислот (Ac3-S- ЛПС). Удаление 3 жирных кислот из молекулы липида А позволило значительно снизить токсичность, характерную для нативного ЛПС. Ранее нами было установлено, что введение экспериментальным животным Ас3-S-ЛПС приводит к замедлению роста первичных опухолевых узлов, образующихся после инокуляции мышам клеток меланомы В16. Культивирование in vitro клеток меланомы В16 с Ас3-S-ЛПС также стимулирует синтез ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-10 и приводит к изменению характера экспрессии поверхностных антигенов - gp100 и MHC I [7].

Полученные в данной работе результаты свидетельствуют о том, что введение внутривенно клеток меланомы после культивирования с агонистом TLR4 приводит к снижению их метастатического потенциала. При этом культивирование клеток меланомы с Ас3-S-ЛПС оказывало значительное влияние на экспрессию Аг на малигнизированных меланоцитах: увеличивалось количество клеток, экспрессирующих TLR4, белки MHC I и рецептор для гиалуроновой кислоты (CD44), и уменьшалось количество клеток, несущих CXCR4 (CD184).

Уменьшение количества клеток, экспрессирующих CXCR4, было зарегистрировано в субпопуляции CD44⁺-меланоцитов. Изменение экспрессии Аг после культивирования клеток с агонистом позволило высказать предположение, что ослабление метастатического потенциала опухолевых клеток после культивирования с агонистом связано с уменьшением количества клеток, несущих CXCR4, так как известно, что отсутствие данного рецептора не позволяет клетке опухоли локализоваться в ткани легкого [18].

Материал и методы

Животные. Мыши линии С57Вl/6J, самки массой 18-20 г, были получены из питомника НПП "Питомник лабораторных животных" (Пущино). Мыши содержались в виварии отдела лабораторных животных НИИ ЭДиТО ФГБУ "НМИЦ им. Н.Н. Блохина" на стандартном пищевом рационе брикетированных экструзированных кормов со свободным доступом к корму и питьевой воде. Все экспериментальные процедуры с животными проводили в соответствии с Правилами исследовательской работы с лабораторными животными в ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России (приказ от 12.11.2015), сертифицированными местным комитетом по этике (резолюция 4/17 от 13.07.2017). Экспериментальные группы животных формировали методом случайной выборки с учетом массы тела в качестве ведущего показателя.

Культивирование клеток. Клетки линии меланомы В16 мышей, хранившиеся при -70 °С, размораживали, дважды центрифугировали в среде RPMI-1640 при 250 g в течение 5 мин. Культивировали клетки в полной культуральной среде (ПКС), состоящей из RPMI-1640 с 25мМ Hepes, 10 % инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 мМ глютамина и 40 мкг/ мл гентамицина (все реактивы "ПанЭко", РФ) в пластиковых культуральных флаконах в СО₂-инкубаторе при 37 °С. На 4-е сутки, после образования плотного монослоя, клетки снимали раствором трипсин-ЭДТА. Полученную клеточную суспензию дважды отмывали центрифугированием при 250 g в течение 5 мин, ресуспендировали, подсчитывали количество живых и мертвых клеток с трипановым синим в камере Горяева и использовали для экспериментов по оценке влияния агониста Ас3-S-ЛПС на образование метастазов и на экспрессию поверхностных Аг.

Индукция образования метастазов. Для изучения влияния агониста Ас3-S-ЛПС на образование метастазов в легких экспериментальных животных клетки меланомы В16 после культивирования в течение 4 сут в ПКС помещали в пластиковые матрасы и доводили концентрацию клеток до 4 - 10⁵/мл. К клеткам добавляли агонист в концентрациях 10 и 0,1 мкг/мл и культивировали в СО₂-инкубаторе при 37 °С 48 ч. По окончании культивирования клетки снимали раствором трипсин-ЭДТА и подсчитывали количество живых клеток с трипановым синим в камере Горяева.

Мышей линии C57Bl/6 фиксировали в специальном приспособлении, нагревали хвост под электрической лампой и вводили клетки меланомы В16 в хвостовую вену в дозе 200 тыс. клеток в 0,5 мл стерильного физиологического раствора. На 21-е сутки осуществляли забой мышей с подсчетом количества метастазов в легких.

Оценка изменений экспрессии поверхностных антигенов. Для оценки влияния Ас3-S-ЛПС на экспрессию поверхностных Аг использовали два метода: проточную цитометрию и анализ опухолевых клеток под флуоресцентным микроскопом.

Клетки линии меланомы В16 мышей, хранившиеся при -70 °С, после размораживания культивировали в течение 4 сут, после чего переносили в пластиковые матрасы и доводили концентрацию клеток до 4 - 10⁵/ мл. К клеткам добавляли Ас3-S-ЛПС в концентрациях 10 и 0,1 мкг/мл и культивировали в СО₂-инкубаторе при 37 °С 48 ч.

Для проточной цитометрии использовали меченые флуорохромами моноклональные Ат (МкАт) CD184 PE, CD MHC I PE, CD274 APC, CD44 FITC, CD24 AРC (eBioscience, США). После окончания культивирования готовили пробы с МкАт согласно инструкции производителя МкАт и анализировали их на проточном цитометре CytoFLEX S (Beckman Coulter, США).

Для анализа экспрессии Аг под флуоресцентным микроскопом после окончания культивирования клетки окрашивали рекомбинантными поликлональными Ат TLR4 (20HLLC) или моноклональными кроличьими Ат к интегрину β5 (D24A5), затем антикроличьим IgG (H+L) фрагментом F(ab')2, конъюгированным с Alexa Fluor 488 и флуоресцентным красителем 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) согласно инструкции фирмы-производителя (eBioscience, США) и анализировали их под флуоресцентным микроскопом Leica 5000B (Leitz, Германия).

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью стандартной прикладной программы Microsoft Excel 2013, рассчитывая средние значения показателей, ошибку средней и достоверность различий по t-критерию Стьюдента. Разницу считали достоверной при уровне значимости р < 0,05. Для анализа изображений, полученных под флуоресцентным микроскопом, использовали программу LAS X Office 1.4.4 26810. При учете результатов регистрировали как процент клеток, экспрессирующих маркер, так и среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ), которую выражали в условных единицах (усл. ед.), соответствующих среднему каналу максимального свечения маркера. Позитивность определяли по отношению к негативному контролю.

Результаты

Влияние детоксицированного липополисахарида Shigella sonnei на метастазирование клеток меланомы В16

Клетки, культивированные с Ас3-S-ЛПС, вводили внутривенно мышам. В качестве контроля экспериментальным животным вводили клетки, которые культивировали без Ас3-S-ЛПС. Полученные результаты представлены на рис. 1 и в табл. 1.

Данные, приведенные в табл. 1, свидетельствуют о том, что предварительное культивирование invitro клеток меланомы В16 с Ас3-S-ЛПС в дозе 0,1 мкг/мл достоверно подавляет способность этих клеток образовывать метастазы в легких. Следует отметить, что опухолевые клетки, использованные для экспериментов, первоначально были получены из первичных узлов, образовавшихся после инокуляции мышам линии C57Bl/6 клеток меланомы В16.

Как уже отмечалось ранее, первичные опухолевые узлы наряду с малигнизированными меланоцитами содержат много других типов клеток, большинство из которых экспрессирует TLR и, следовательно, могут активироваться Ас3-S-ЛПС. Поэтому перед культивированием с Ас3-S-ЛПС опухолевые клетки 6-кратно пассировали invitro, так как известно, что через несколько пассажей после выделения из опухоли раковые клетки полностью вытесняют все остальные и клеточная культура становится достаточно однородной.

Влияние культивирования invitro клеток меланомы В16 с детоксицированным липополисахаридом Shigella sonnei на экспрессию рецептора к TLR4

Ранее нами было установлено, что клетки линии меланомы В16, которую мы использовали для экспериментов, экспресcируют рецептор к TLR4 [7]. В свою очередь, детоксицированный ЛПС получен из грам-отрицатальных микроорганизмов и по своей природе является патоген-ассоциированным молекулярным паттерном, который при встрече с клеткой, несущей TLR4, будет ее активировать, являясь агонистом данного рецептора.

Как мы показали ранее, культивирование клеток меланомы В16 с детоксицированным ЛПС Shigella sonnei стимулирует синтез провоспалительных цитокинов [7]. Однако оставалось не ясно, меняется ли при этом экспрессия данного Аг на опухолевых клетках. Для ответа на этот вопрос клетки меланомы В16 культивировали с Ас3-S-ЛПС в течение 48 ч, фиксировали и затем окрашивали сначала рекомбинантными поликлональными Ат к TLR4, а затем вторичными Ат, мечеными флуоресцентным красителем Alexa Fluor 488. Затем клеточные препараты анализировали под флуоресцентным микроскопом и оценивали СИФ, выраженную в условных единицах (усл. ед.), соответствующих среднему каналу максимального свечения маркера. Интенсивность флуоресценции отдельных клеток определяли с помощью программы LAS X Office 1.4.4 26810 фирмы Leica (рис. 2).

Полученные результаты позволяют сделать заключение, что культивирование клеток меланомы В16 с детоксицированным липополисахаридом Shigella sonnei приводит к увеличению экспрессии TLR4.

Влияние культивирования invitroклеток меланомы В16 с детоксицированным липополисахаридом Shigella sonnei на экспрессию антигенов CXCR4, MHCI, PD-L1, CD44 и CD24

На следующем этапе работы мы изучили влияние Ас3-S-ЛПС на ряд других Аг, представленных на клетках меланомы В16, от которых может зависеть способность этих клеток образовывать метастазы в легких. Для анализа изменения экспрессии Аг после культивирования опухолевых клеток с Ac3-S-ЛПС были использованы следующие моноклональные Ат: CD184 PE (к рецептору хемокина CXCR4), CD MHC I PE (к МНС I), CD274 APC (к PD-L1), CD44 FITC (к рецептору для гиалуроновой кислоты) и CD24 APC - к маркеру опухолевых стволовых клеток.

После окончания культивирования с Ас3-S-ЛПС клетки меланомы В16 окрашивали флуоресцентно мечеными Ат согласно инструкции фирмы-производителя Ат и анализировали на цитометре CytoFLEX S (Beckman Coulter, США). Полученные результаты представлены в табл. 2.

При исследовании поверхностных Аг клеток меланомы В16 после культивирования с Ас3-S-ЛПС было установлено, что увеличилось количество клеток, экспрессирующих белки МHC класса I (в 1,6 раза), что подтверждает ранее полученные нами результаты о способности детоксицированного ЛПС Shigella sonnei увеличивать экспрессию этих Аг на клетках меланомы В16 [7]. Также повысилось в 1,7 раза количество клеток, несущих белок PD-L1, и количество клеток, несущих рецептор для гиалуроновой кислоты (CD44). Практически не изменилось количество клеток, несущих маркер опухолевых стволовых клеток. При этом почти в 2 раза уменьшилось количество клеток, экспрессирующих рецептор CXCR4, лиганд к которому CXCL12 (stromal cell-derived factor 1, SDF-1) широко представлен в ткани легкого [18]. Учитывая значение для образования метастазов присутствия на опухолевых клетках CXCR4, в следующей серии экспериментов мы изучили влияние Ac3-S-ЛПС на экспрессию этого рецептора на клетках меланомы В16, несущих рецептор для гиалуроновой кислоты, маркер опухолевых стволовых клеток CD24 и лиганд к PD-1 - PD-L1. Мы также оценили влияние Ac3-S-ЛПС на количество клеток, экспрессирующих MHC I/CD274. Полученные результаты представлены в табл. 3.

Установлено, что культивирование в течение 48 ч клеток меланомы линии В16 с агонистом TLR4 приводит к уменьшению в 2,8 раза количества клеток, экспрессирующих Аг CD184/CD44, и практически не влияет на количество клеток, несущих CD184/CD24 и CD184/CD274.

Культивирование опухолевых клеток с Ас3-S-ЛПС также привело к увеличению в популяции малигнизированных меланоцитов, экспрессирующих белки MHC I и PD-L1 (см. табл. 3 и рис. 3).

Еще одной поверхностной клеточной структурой, играющей большую роль в клеточной миграции и метастазировании, являются β-интегрины, фосфорилирование которых приводит к разрушению связей опухолевых клеток с базальной мембраной, в результате чего значительно увеличивается их подвижность и инвазивность. Экспериментально доказано участие интегринов в формировании высокоагрессивного фенотипа опухоли меланомы [19].

Для оценки влияния Ас3-S-ЛПС на экспрессию малигнизированными меланоцитами интегрина αvβ5 препараты клеток меланомы В16 после культивирования с детоксицированным ЛПС S. sonnei анализировали под флуоресцентным микроскопом, определяли интенсивность флуоресценции отдельных клеток, выраженную в усл. ед., соответствующих среднему каналу максимального свечения флуоресцентного маркера вторичных Ат, с помощью программы LAS X Office 1,4.4 26810 фирмы Leica и затем подсчитывали СИФ (рис. 4).

Полученные результаты позволяют сделать заключение, что культивирование клеток меланомы В16 с детоксицированным липополисахаридом Shigella sonnei не оказывает влияния на экспрессию интегрина αvβ5.

Обсуждение

В работе представлены результаты, свидетельствующие о том, что воздействие на клетки меланомы В16 агониста Толл-подобного рецептора в культуре invitro вызывает изменения поверхностных рецепторов злокачественных клеток, которые сохраняются и в дальнейшем, после введения этих клеток invivo, и могут оказывать существенное влияние на образование метастазов. Установлено, что культивирование клеток меланомы линии В16 с детоксицированным ЛПС Shigella sonnei, фаза 1, приводит к уменьшению способности этих клеток образовывать метастазы после введения внутривенно экспериментальным животным. Максимальный достоверный эффект наблюдался при достаточно низкой дозе ЛПС (0,1 мкг/мл культуральной среды). Ранее нами было показано, что клетки линии меланомы В16, которую мы использовали для экспериментов, экспрессируют TLR4, агонистом которого является детоксицированный ЛПС Shigella sonnei [7].

Результаты, представленные в этой работе, свидетельствуют о том, что культивирование клеток меланомы с агонистом приводит к увеличению экспрессии TLR4. При этом в ряде опубликованных научных исследований показано, что активация TLR4 на опухолевых клетках, наоборот, стимулирует образование метастазов [10].

В то же время полученные нами результаты свидетельствуют об обратном. Аналогичные данные были получены V. Andreani и соавт. [17], которые показали, что стимуляция invitro ЛПС E. coli клеток меланомы В16 приводит к замедлению образования опухолей после инокуляции этих клеток лабораторным животным. При этом при культивировании опухолевых клеток с агонистом TLR4 происходит изменение спектра синтезируемых клетками цитокинов, увеличивается синтез ИФН-γ и подавляется синтез ИЛ-10.

Следует отметить, что увеличение метастазирования, которое наблюдали после воздействия агонистов TLR на злокачественные опухоли, было обусловлено воспалительными реакциями, в которых существенную роль играли клетки опухолевого микроокружения. В то же время результаты непосредственного взаимодействия агонистов с TLR на малигнизированных меланоцитах, как это было в наших экспериментах, в настоящее время изучены недостаточно и полученные данные носят противоречивый характер, хотя понимание механизмов взаимодействия стимуляторов врожденного иммунитета с TLR на клетках злокачественных опухолей необходимо, учитывая наметившуюся в наши дни тенденцию к более широкому применению этих препаратов в лечении пациентов с онкологическими заболеваниями.

Установлено, что TLRs не функционируют изолированно, а взаимодействуют с другими рецепторами в мультирецепторных комплексах внутри липидных рафтов мембраны [20]. Так, показано, что активация агонистом хемокинового рецептора CXCR4 в моноцитах человека или макрофагах мыши вызывает стимуляцию цАМФ-зависимой протеинкиназы A, которая, в свою очередь, подавляет вызванную TLR активацию NF-κB в ответ на микробный патоген [21].

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что возможен и обратный эффект, когда стимуляция TLR4 на малигнизированных меланоцитах детоксицированным ЛПС Shigella sonnei приводит к уменьшению количества клеток, несущих рецептор CXCR4. Избыточная экспрессия CXCR4 в раковых клетках способствует росту опухоли, инвазии, ангиогенезу, метастазированию, рецидиву и терапевтической резистентности [22].

Специфическим лигандом для CXCR4 является вырабатываемый стромальными клетками хемокиновый фактор CXCL12. CXCL12 является единственным известным хемокином, который связывается с CXCR4. Экспрессирующие CXCR4 клетки реагируют на градиенты CXCL12 и мигрируют по ним в различные органы, такие как печень, легкие, почки, головной мозг и костный мозг.

CXCR4 сверхэкспрессируется при более чем 23 различных типах рака человека, включая рак почки, легких, головного мозга, предстательной железы, молочной железы, поджелудочной железы, яичников и кожи (меланомы) и способствует росту опухоли, ангиогенезу, метастазированию и терапевтической резистентности. Экспрессия CXCR4 клетками меланомы при первичных поражениях коррелирует с увеличением толщины опухоли, изъязвлением, более высоким риском региональных и отдаленных метастазов и более высокими показателями смертности. Показано, что клетки меланомы В16, экспрессирующие высокий уровень CXCR4, образуют гораздо больше метастазов в легких, чем клетки с низким уровнем экспрессии этого рецептора.

Было обнаружено, что CXCR4 и матриксная металлопротеиназа 1-го типа (MT1-MMP) координируют свою деятельность на разных этапах метастазирования клеток меланомы в легкие. CXCR4 играет важную роль на начальных этапах миграции клеток меланомы и их перемещения в легкие. MT1-MMP, напротив, не задействован на начальном этапе, но способствует последующему распространению и инвазии CXCR4-положительных опухолевых клеток [23]. С большой долей вероятности можно утверждать, что снижение метастатического потенциала клеток меланомы В16 после культивирования с детоксицированным ЛПС Shigella sonnei обусловлено уменьшением количества клеток, экспрессирующих CXCR4.

Следует отметить, что экспрессия CXCR4 уменьшилась на клетках, несущих другой играющий большую роль в метастазировании Аг - рецептор для гиалуроновой кислоты CD44 и в то же время практически не изменилась на клетках, экспрессирующих маркер опухолевых стволовых клеток CD24 и белок PD-L1.

CD44 является рецептором адгезии на клеточной поверхности, который высоко экспрессируется при многих видах рака и регулирует метастазирование посредством рекрутирования CD44 на клеточную поверхность [24]. Его взаимодействие с соответствующими лигандами внеклеточного матрикса способствует процессам миграции и инвазии, вовлеченным в метастазирование. CD44 участвует в захвате и деградации гиалуроновой кислоты, а также в передаче сигналов апоптоза [25].

Гиалуроновая кислота - является важным компонентом внутриклеточного матрикса и главным лигандом CD44. Многие опухолевые клетки, также как и клетки метастазов, экспрессируют высокий уровень CD44. На экспериментальных моделях показано, что инъекция веществ, влияющих на CD44, угнетает локальный рост опухоли и распространение метастазов. Таким образом, CD44 может предоставлять опухолевым клеткам преимущество в росте, эмиграции из первичных опухолевых узлов и образовании метастазов.

Полученные нами результаты свидетельствуют об увеличении количества опухолевых клеток, экспрессирующих белок PD-L1, после культивирования с Ac3-S-ЛПС (см. табл. 2). Известно, что белок PD-L1 является лигандом рецептора PD-1 и экспрессируется на активированных клетках, участвующих в противоопухолевом иммунном ответе, включая CD4⁺- и CD8⁺-T-клетки, B-клетки, НК-клетки, моноциты, дендритные клетки, макрофаги. Установлено, что взаимодействие PD-1 с его лигандами PD-L1 или PD-L2 ограничивает активность эффекторных Т-клеток и тем самым предотвращает развитие возможных аутоиммунных реакции [26].

PD-L1 представлен конститутивно на большинстве гемопоэтических клеток, на паренхиматозных клетках поджелудочной железы и эндотелия сосудов. В тоже время, экспрессия PD-L1 была обнаружена также на клетках многих типов злокачественных опухолей [27], в том числе на малигнизированных меланоцитах [28]. Взаимодействие PD-1/PD-L1 ингибирует пролиферацию Т-лимфоцитов, выживаемость и эффекторные функции (цитотоксичность, секреция цитокинов), индуцирует апоптоз антиген-презентирующих Т-клеток, способствует дифференцировке CD4⁺-Т-клеток в регуляторные FOXP3⁺-клетки, обеспечивает резистентность опухолевых клеток к цитотоксическому ответу [29]. Считается, что опухолевые клетки используют сигнальный путь PD-1 для ингибирования Т-клеточного иммунного ответа.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что в популяции опухолевых клеток линии меланомы В16, которую мы использовали для экспериментов, количество клеток, экспрессирующих PD-L1, весьма незначительно - 2,4 %, тем не менее следует отметить, что оно увеличивалось до 4,1 % после культивирования с Ac3-S-ЛПС (см. табл. 2). Согласно клиническим наблюдениям, повышенная экспрессия PD-L1 на клетках меланомы может увеличивать вероятность образования метастазов. Однако, по-видимому, в данном случае этот эффект не оказывал значительного влияния на снижение метастатического потенциала клеток меланомы В16 после культивирования с Ac3-S-ЛПС.

Следует также отметить, что культивирование клеток меланомы с Ac3-S-ЛПС приводит к снижению количества клеток, экспрессирующих CD184/CD44 (см. табл. 3), и в то же время общее количество клеток, несущих рецептор для гиалуроновой кислоты, в популяции опухолевых клеток увеличивается. В свою очередь, в культурах, в которые добавляли Ac3-S-ЛПС, увеличилось количество клеток, экспрессирующих MHC I/CD274, т. е. на клетках, несущих белки главного комплекса гистосовместимости, играющих ключевую роль в представлении Аг Т-лимфоцитам, также присутствует лиганд PD-L1. Значение для развития противоопухолевого иммунного ответа одновременного присутствия на клетках меланомы В16 белков MHC I и PD-L1 и влияние на их экспрессию агониста TLR4 в настоящее время не ясно и требует дополнительных исследований.

Заключение

В данной работе представлены результаты изучения непосредственного воздействия на малигнизированные меланоциты агониста TLR4 детоксицированного ЛПС Shigella sonnei,фаза 1. Показано, что культивирование клеток опухоли меланомы линии В16 с агонистом TLR4 ингибирует способность образовывать метастазы в легких после внутривенного введения клеток мышам линии С57Bl/6. Культивирование малигнизированных меланоцитов с агонистом также приводило к увеличению экспрессии на поверхности опухолевых клеток TLR4, снижению в популяции количества клеток, несущих хемокиновый рецептор CXCR4, и к увеличению количества клеток, экспрессирующих рецептор для гиалуроновой кислоты.

Из данных литературы известно, что стимуляция рецептора CXCR4 может приводить к подавлению ответа TLR на микробные патогены. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что возможен и обратный эффект, когда стимуляция TLR приводит к снижению экспрессии CXCR4.

Исходя из полученных нами данных, можно сделать заключение, что подавление метастатического потенциала клеток меланомы В16 после культивирования с детоксицированным ЛПС Shigella sonnei, фаза 1, связано со снижением экспрессии CXCR4. Иными словами, малигнизированные меланоциты благодаря повышенной экспрессии рецептора для гиалуроновой кислоты (CD44) легче проникают в сосудистое русло, но отсутствие на их поверхности CXCR4 не позволяет им локализоваться в легочной ткани.

Литература

1. Zhou S., Lu J., Liu S., Shao J., Liu Z., Li J., Xiao W. Role of the tumor microenvironment in malignant melanoma organoids during the development and metastasis of tumors. Front. Cell Dev. Biol. Sec. Cancer Cell Biology. 2023; 11: 1166916. DOI: https://doi.org/10.3389/fcell.2023.1166916
2. Marzagalli M., Ebelt N.D., Manuel E.R. Unraveling the crosstalk between melanoma and immune cells in the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 2019; 59: 236-50. DOI: https://doi.org/10.1016/j.semcancer. 2019.08.002
3. ПичугинА.В., ПодсвироваС.А., Ушакова Е.И., Спирин Д.М., Лебедева Е.С., Атауллаханов Р.И. Перепрограммирование миелоидных клеток опухолевого микроокружения повышает эффективность блокады рецепторов CTLA-4 и PD-1 при иммунотерапии злокачественной меланомы в эксперименте. Иммунология. 2022; 43 (6): 673-90. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-6-673-690
4. Гапонова А.В., Родин С., Мазина А.А., Волчков П.Ю. Эпителиально-мезенхимальный переход: злокачественная прогрессия и перспективы противоопухолевой терапии. ActaNaturae. 2020; 12 (3): 4-23. DOI: https://doi.org/10.32607/actanaturae.11010
5. Рыбкина В.Л., Адамова Г.В., Ослина Д.С. Роль цитокинов в патогенезе злокачественных новообразований. Сибирскийнаучныймедицинский журнал. 2023; 43 (2): 15-28. DOI: https://doi.org/10.18699/SSMJ20230202
6. Yasufumi G., Takaaki A., Minoru K., Sandy L.N., Norihiko N., Soldano F., Donald L.M., Reiko F.I., Dave S.B. Activation of toll-like receptors 2, 3, and 4 on human melanoma cells induces inflammatory factors. Mol. Cancer Ther. 2008; 7 (11): 3642-53. DOI: https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-08-0582
7. НовиковаЕ.М., ЧухинаЕ.С., Разваляева Н.А., Козырева О.В., Головина М.Э., Львов В.Л., Апарин П.Г., Степаненко Р.Н. Влияние детоксифицированного липополисахарида Shigella sonnei на экспрессию клетками меланомы В16 опухоль ассоциированного антигена gp100 и антигенов MHC I. Иммунология. 2024; 45 (1): 68-81. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-1-68-81
8. Kashani B., Zandi Z., Pourbagheri-Sigaroodi A., Bashash D., Ghaffari S.H. The role of toll-like receptor 4 (TLR4) in cancer progression: A possible therapeutic target? J. Cell Physiol. 2021; 236: 4121-37. DOI: https://doi.org/10.1002/jcp.30166
9. Takazawa Y., Kiniwa Y., Ogawa E., Uchiyama A., Ashida A., Uhara H., Goto Y., Okuyama R. Toll-like receptor 4 signaling promotes the migration of human melanoma cells. Tohoku J. Exp. Med. 2014; 234 (1): 57-65. DOI: https://doi.org/10.1620/tjem.234.57
10. Kanzler H., Barrat F.J., Hessel E.M., Coffman R.L. Therapeutic targeting of innate immunity with Toll-like receptor agonists and antagonists. Nat. Med. 2007; 13: 552-9. DOI: https://doi.org/10.1038/nm1589
11. Yu L.-X., Yan H.-X., Liu Q., Yang W., Wu H.-P., Dong W., Tang L., Lin Y., He Y.-Q., Zou S.-S., Wang C., Zhang H.-L., Cao G.-W., Wu M.-C., Wang H.-Y. Endotoxin accumulation prevents carcinogen-induced apoptosis and promotes liver tumorigenesis in rodents. Hepatology. 2010; 52: 1322-33. DOI: https://doi.org/10.1002/hep.23845
12. Levy L., Hill C.S. Alterations in components of the TGF-b superfamily signaling pathways in human cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 2006; 17 (1-2): 41-58. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cytogfr.2005.09.009
13. Jing Y.Y., Han Z.-P., Sun K., Zhang S.-S., Hou J., Liu Y., Li R., Gao L., Zhao X., Zhao Q.-D., Wu M.-C., Wei L.-X. Toll-like receptor 4 signaling promotes epithelial-mesenchymal transition in human hepatocellular carcinoma induced by lipopolysaccharide. BMC Med. 2012; 10: 98. DOI: https://doi.org/10.1186/1741-7015-10-98
14. Harmey J.H., Bucana C.D., Lu W., Byrne A.M., McDonnell S., Lynch C., Bouchier-Hayes D., Dong Z. Lipopolysaccharide-induced metastatic growth is associated with increased angiogenesis, vascular permeability and tumor cell invasion. Int. J. Cancer. 2002; 10: 101 (5): 415-22. DOI: https://doi.org/10.1002/ijc.10632
15. Rodriguez-Martinez S., Cancino-Diaz M.E., Miguel P.S., Cancino-Diaz J.C. Lipopolysaccharide from Escherichia coliinduces the expression of vascular endothelial growth factor via toll-like receptor 4 in human limbal fibroblasts. Exp. Eye Res. 2006; 83: 1373-7. DOI: https://doi.org/10.1016/j.exer.2006.07.015
16. Fu X.-Q., Liu B., Wang Y.-P., Li J.-K., Zhu P.-L., Li T., Tse K.-W., Chou J.-Y., Yin C.-L., Bai J.-X., Liu Y.-X., Chen Y.-J., Yu Z.-L. Activation of STAT3 is a key event in TLR4 signaling-mediated melanoma progression. Cell Death Dis. 2020; 11 (4): 246. DOI: https://doi.org/10.1038/s41419-020-2440-1
17. Andreani V., Gatti G., Simonella L., Rivero V., Maccioni M. Activation of Toll-like receptor 4 on tumor cells in vitro inhibits subsequent tumor growth in vivo. Cancer Res. 2007; 67 (21): 10519-27. DOI: https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-07-0079
18. Payne A.S., Cornelius L.A. The role of chemokines in melanoma tumor growth and metastasis. J. Invest. Dermatol. 2002; 118 (6): 915-22. DOI: https://doi.org/10.1046/j.1523-1747.2002.01725.x
19. Huang R., Rofstad E.K. Integrins as therapeutic targets in the organ-specific metastasis of human malignant melanoma. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2018; 27: 37 (1): 92. DOI: https://doi.org/10.1186/s13046-018-0763-x
20. Hajishengallis G., Tapping R.I., Harokopakis E., Nishiyama S., Ratti P., Schifferle R.E., Lyle E.A., Triantafilou M., Triantafilou K., Yoshimura F. Differential interactions of fimbriae and lipopolysaccharide from Porphyromonas gingivalis withthe Toll-like receptor 2-centred pattern recognition apparatus. Cellular Microbiology. 2006; 8 (10): 1557-70. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1462-5822.2006.00730
21. Hajishengallis G., Min W., Liang S., Triantafilou M., Triantafilou K. Pathogen induction of CXCR4/TLR2 cross-talk impairs host defense function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105 (36): 13532-7. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.0803852105
22. Титов К.С., Ротин Д.Л., Казаков А.М., Щербакова Е.А. Роль интегринов в инвазии и метастазировании злокачественных опухолей кожи. Злокачественныеопухоли. 2016; 1: 5-9. DOI: https://doi.org/10.18027/2224-5057-2016-1-5-9
23. Chatterjee S., Azad B.B., Nimmagadda S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv. Cancer Res. 2014; 124: 31-82. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-411638-2.00002-1
24. Senbanjo L.T., Meenakshi A.C. CD44: A multifunctional cell surface adhesion receptor is a regulator of progression and metastasis of cancer cells. Front. Cell Dev. Biol. Sec. Cell Adhesion and Migration. 2017; 7: 5: 18. DOI: https://doi.org/10.3389/fcell.2017.00018
25. Naor D., Sionov R.V., Ish-Shalom D. CD44: structure, function, and association with the malignant process. Adv. Cancer Res. 1997; 71: 241-319. DOI: https://doi.org/10.1016/s0065-230x(08)60101-3
26. Okazaki T., Honjo T. PD-1 and PD-1 ligands: from discovery to clinical application. Int. Immunol. 2007; 19 (7): 813-24. DOI: https://doi.org/10.1093/intimm/dxm057
27. КлючагинаЮ.И., СоколоваЗ.А., Барышникова М.А. Роль рецептора PD1 и его лигандов PDL1 и PDL2 в иммунотерапии опухолей. Онкопедиатрия. 2017; 4 (1): 49-55. DOI: https://doi.org/10.15690/onco.v4i1.1684
28. Liu J., Hamrouni A., Wolowiec D., Coiteux V., Kuliczkowski K., Hetuin D., Saudemont A., Quesnel B. Plasma cells from multiple myeloma patients express B7-H1 (PD-L1) and increase expression after stimulation with IFNgamma and TLR ligands via a MyD88-, TRAF6-, and MEK-dependent pathway. Blood. 2007; 110 (1): 296-304. DOI: https://doi.org/10.1182/blood-2006-10-051482
29. Саяпина М.С. Иммунорегуляторные функции ингибиторов PD-1/PD-L1 и развитие к ним резистентности. Злокачественныеопухоли. 2017; (2): 94-9. DOI: https://doi.org/10.18027/2224-5057-2017-2-94-99

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)