Фенотип и продукция цитокинов TCR-подобными CAR/CAR/TCR-T-клетками при контакте со сфероидами опухолевых клеток in vitro

• Булыгин Алексей Сергеевич
• Филиппова Юлия Григорьевна
• Алсаллум Алаа
• Алрхмун Салех
• Киреев Федор Дмитриевич
• Шевченко Юлия Александровна
• Фишер Марина Сергеевна
• Перик-Заводский Роман Юрьевич
• Перик-Заводская Ольга Юрьевна
• Назаров Кирилл Вячеславович
• Шику Хироши
• Голикова Елена Алексеевна
• Облеухова Ирина Александровна
• Силков Александр Николаевич
• Сенников Сергей Витальевич

Резюме

Введение. За последнее десятилетие в терапии онкологических заболеваний появились технологии c использованием Т-клеток с модифицированными T-клеточными рецепторами, которые позволяют распознавать опухолевые антигены различной природы и локализации. Для некоторых типов таких клеток была показана высокая эффективность в лечении онкологических заболеваний системы крови, однако успехи в терапии солидных опухолей все еще скромны. Применение трехмерных культур (3D) для определения механизмов действия генетически модифицированных Т-клеток дает дополнительные возможности в понимании механизмов, направленных на элиминацию солидной опухоли.

Цель - определение фенотипа и продукции цитокинов TCR-подобными CAR/CAR/TCR-T-клеток при контакте с опухолями в виде 3D-культур.

Материал и методы. TCR-подобные CAR/CAR/TCR-T-клетки получали с помощью трансдукции клеток периферической крови здоровых доноров γ-ретровирусными векторами. Фенотип полученных после трансдукции TCR-подобных CAR/CAR/TCR-T-клеток оценивали с помощью проточной цитометрии и последующего биоинформатического анализа, позволяющего выявлять различные кластеры клеток. 3D-культуры опухолевой линии клеток меланомы SK-MEL-37 получали с помощью метода "висячая капля". Продукцию цитокинов в культуре TCR-подобных CAR/CAR/TCR-T-клеток и 3D-сфероида линии меланомы SK-MEL-37 оценивали с помощью мультиплексного анализа.

Результаты. В популяции полученных после трансдукции TCR-подобных CAR/TCR/CAR-Т-клеток доминирующими являются кластеры эффекторных CD4⁺- и CD8⁺-Т-клеток. Анализ продукции цитокинов показал, что в совместной культуре модифицированных T-клеток 3D-сфероида меланомы SK-MEL-37 преобладающими противоопухолевыми механизмами являются продукция гранзимов, гранулизина и ИФН-γ.

Заключение. Трансдукция γ-ретровирусными векторами, нацеленными на антигены солидных опухолей, ведет к образованию эффекторных Т-клеток, способных к продукции цитолитических и эффекторных молекул, направленных на лизис опухолевых клеток в 3D-модели опухолевого роста и привлечение различных иммунных клеток, что делает перспективным применение Т-клеток с генетически модифицированными рецепторами для разработки клинических стратегий терапии солидных опухолей.

Ключевые слова: TCR-подобные CAR/CAR/TCR-T-клетки; SK-MEL-37; 3D-сфероид; проточная цитометрия; цитокины

Введение

За последнее десятилетие в терапии онкологических заболеваний появились технологии c использованием Т-клеток с модифицированными T-клеточными рецепторами, которые позволяют распознавать опухолевые антигены различной природы и локализации. Для некоторых типов таких клеток была показана высокая эффективность в лечении онкологических заболеваний системы крови, однако успехи в терапии солидных опухолей все еще скромны. Применение трехмерных культур (3D) для определения механизмов действия генетически модифицированных Т-клеток дает дополнительные возможности в понимании механизмов, направленных на элиминацию солидной опухоли.

На сегодняшний день многие исследователи с каждым шагом совершенствуют методы лечения онкологических заболеваний для повышения эффективности и увеличения безрецидивного периода. Когда традиционные методы не справляются с определенными злокачественными новообразованиями, адоптивная клеточная терапия (АКТ) как более специфичный метод борьбы с опухолями может прийти на помощь пациентам. АКТ включает различные стратегии повышения активности Т-лимфоцитов и других эффекторных клеток с целью активации механизмов противоопухолевого иммунитета: создание химерных антигенных рецепторов (CAR), использование Т-клеток с модифицированным геном Т-клеточного рецептора (TCR) и терапию с использованием лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль [1]. Преимущества АКТ состоит в том, что клетки с модифицированными Т-клеточными рецепторами способны распознавать опухолевые антигены различной структуры и локализации, даже при очень слабой экспрессии антигена, что приводит к большему пулу мишеней и, следовательно, повышению общей эффективности уничтожения [2]. Позитивный опыт применения CAR-T-клеток при некоторых гематологических злокачественных новообразованиях послужил стимулом для исследования применения АКТ у пациентов с солидными опухолями. Однако АКТ для солидных опухолей разрабатывается довольно медленно из-за ограничений целевой специфичности и иммуносупрессивного микроокружения [3, 4].

Использование 3D-культур опухолевых клеток может быть отличным инструментом для моделирования взаимодействия с солидной опухолью in vivo. Например, было показано, что с помощью 3D-сфероидов можно определить цитотоксический потенциал CAR-T-клеток [5]. По сравнению с классической монослойной культурой клеток in vitro, 3D-модели лучше отражают биологическую реальность опухолей и их микроокружение, а Т-клетки находятся в более сложных условиях для борьбы с опухолевыми клетками. Например, было показано, что Т-клетки показывали более слабую супрессорную активность в 3D-культуре по сравнению с обычной монослойной культурой клеток [6].

Таким образом, цель нашего исследования - определение фенотипа различных типов модифицированных T-клеток (TCR-подобные CAR/CAR/TCR-T-клетки), полученных с помощью трансдукции γ-ретровирусными векторами, кодирующими рецепторы для распознавания антигенов солидных опухолей, и исследование их способности к реализации цитотоксических функций в 3D-культуре против сфероида опухолевых клеток линии меланомы SK-MEL-37.

Материал и методы

Получение генетически модифицированных Т-лимфоцитов. Для получения TCR Т-клеток (специфичных к NY-ESO-1), TCR-подобных CAR-Т-клеток (специфичных к MAGE-A4) и CAR-Т-клеток GD2 (специфичных к GD2), были использованы γ-ретровирусные векторы [7-9], полученные в Высшей школе медицины Университета Миэ (Япония) под руководством профессора Х. Шику.

Участники исследования. Получение периферической крови от здоровых взрослых доноров одобрено локальным этическим комитетом НИИФКИ Минобрнауки России (протокол № 139 от 30.05.2022). В исследовании участвовали 6 доноров обоих полов, средний возраст варьировал от 25 до 35 лет.

Выделение и мононуклеарных клеток и ретровирусная трансдукция. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из периферической крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла-урографина (ρ = 1,077 г/л, "ПанЭко", Россия). МНК в концентрации 0,75 млн/мл в 2 мл среды GT-T551 (Takara Bio, Япония), содержащей 300 ЕД/мл ИЛ-2 (Ронколейкин, Россия) и 0,6 % сыворотки крови IV группы, помещали в лунку 12-луночного планшета, предварительно покрытого ретронектином (25 мкг/мл, Takara Bio, Япония) и анти-CD3-антителами (5 мкг/ мл, Biolegend, США), со сменой половины среды на 2-й и на 3-й день культивирования. Поверхность лунок 24-луночного планшета для ретровирусной трансдукции предварительно покрывали 25 мкг/мл ретронектина за день до трансдукции. Растворы ретровирусов разводили PBS, содержащим 2 % сывороточного альбумина человека, и 5 % раствором цитратного буфера с добавлением глюкозы (ACD- A), добавляли по 1 мл в лунки планшета с ретронектином и центрифугировали с ускорением 2000 g в течение 2 ч при 32 ^оС. После удаления раствора ретровирусов в лунки добавляли полученные активированные лимфоциты (преимущественно CD3⁺-Т-лимфоциты) в концентрации 0,2 млн/мл в 1,5 мл среды с добавлением содержащей 300 ЕД/мл ИЛ-2 (Ронколейкин, Россия) и 0,6 % сыворотки крови IV группы и центрифугировали при ускорении 1000 g в течение 10 мин при 32 ^оС. Вирусную трансдукцию повторяли через 16-18 ч, а затем клетки переносили в 6-луночные планшеты с добавлением 1,5 мл культуральной среды, содержащей 300 ЕД/мл ИЛ-2 (Ронколейкин, Россия) и 0,6 % сыворотки крови IV группы.

Эффективность трансдукции Т-лимфоцитов и фенотип получаемых клеток. Оценка эффективности трансдукции и фенотипа проводилась с помощью проточной цитометрии. Аликвоты клеток в объеме 100 мкл метили биотинилированными коммерческими антителами Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Mouse IgG, F(ab')₂ fragment specific (Jackson Immunoresearch, США) для визуализации прошедших трансдукцию TCR-подобных CAR-Т-клеток и CAR-Т-клеток тетрамерами к эпитопам антигена NY-ESO-1 для визуализации прошедших трансдукцию TCR-Т-клеток, а затем PE-конъюгированным стрептавидином (Biolegend, США). Для изучения фенотипа те же клетки далее метили моноклональными антителами, мечеными флурохромами: анти-CD8-PeCy7, анти-CD3-AF700, анти-CD45RA-Bv711, анти-CD62L-AF488, анти-CD95(Fas)-PerCP-Cy5.5, анти-CD69-AF647, анти-TIM-3-APC/Cy7, анти-PD-1-BV421 (Biolegend, США) и анализировали с помощью проточного цитометра Attune NxT (Thermo Fisher, США).

Мы экспортировали .fsc файлы из рабочей программы Attune NxT и преобразовали их в файлы .csv, используя собственный скрипт, составленный с использованием языка программирования Python 3 через Jupyter Notebooks (Anaconda, США). Полученные файлы .csv импортировали в Seurat V5 [10], проводили контроль качества данных (nCountAb < 1 000 000), нормализацию данных с помощью центрированного логарифмического отношения (CLR), пакетную коррекцию и интеграцию с помощью Harmony [11], алгоритм уменьшения размерности Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) с использованием 7 главных компонентов с гармонической коррекцией, найденных соседей и найденных кластеров. Мы идентифицировали кластеры с помощью визуализация данных в формате FeaturePlot экспрессии маркеров, агломерировали и переименовывали кластеры для соответствия субпопуляциям биологических Т-клеток. Затем мы создали интеграцию Harmony DimPlot, Cluster DimPlot, DotPlot экспрессии маркера и создали график StackedBar, используя ggplot2.

Получение сфероидов линии SK-MEL-37. Линия меланомы SK-MEL-37 имеет высокий уровень экспрессии (≥ 80 %) поверхностного антигена GD2 и внутриклеточной экспрессии антигенов NY-ESO-1 и MAGE-A4. Данные по экспрессии этих антигенов были получены из литературных источников [12-14] и дополнительно подтверждены нами самостоятельно с помощью моноклональных антител для проточной цитометрии. Клеточная линия SK-MEL-37 была предоставлена профессором Х. Шику из коллекции Высшей школы медицины Университета Миэ (Япония). Для получения сфероида опухолевых клеток по методу "висячей капли" мы использовали культуральную среду RPMI-1640 с добавлением 10 % фетальной телячьей сыворотки (FCS) (HiMediа, Индия), 2 мм L-глютамина ("Биолот", Россия), 5 × 10-4 М2-меркаптоэтанола (Sigma-Aldrich, США), 25 мМ HEPES ("Биолот", Россия), 80 мкг/мл гентамицина ("Биолот", Россия), 100 мкг/мл бензилпенициллина ("Синтез", Россия), 0,5 % и карбоксиметилцеллюлозы (Sigma-Aldrich, США) для стабильного формирования сфероидных структур.

Опухолевые клетки добавляли из расчета от 1 - 10⁴ клеток/каплю (1 капля = 25 мкл). Смесь опухолевых клеток [1 - 10⁴ клеток/каплю (1 капля = 25 мкл)], среды и метилцеллюлозы раскапывали на крышку чашки Петри в виде капель объемом 25 мкл.

Для создания локальной влажной атмосферы с сохранением солевого баланса в чашку Петри добавляли 25 мл фосфатного буферного раствора ("Биолот", Россия). Капля не растекалась по поверхности благодаря силе тяжести и поверхностному натяжению, что позволяет образовать сфероид на дне капли. Метилцеллюлоза повышает вязкость среды и позволяет капле с клетками лучше держаться в висячем вертикальном положении. Далее крышку с каплями аккуратно переворачивали и инкубировали в CO₂-инкубаторе в течение 7 дней. На 7-й день культивирования крышку чашки Петри снимали и сформированные сфероиды аккуратно смывали сверху вниз. Сфероиды собирали наконечником и помещали в лунки 96-луночного планшета с добавлением 200 мкл среды на 1 сфероид.

Затем сфероид культивировали со сменой среды каждые 48 ч до достижения размера в 1 мм. Cфероид считается оптимальным для эксперимента, если имеется выраженное разделение сфероида на зону пролиферации и зону покоя [15]. Формирование зон пролиферации и покоя в полученных сфероидах оценивали по окраске суправитальными красителями кальцеином (Biolegend, США) для определения живых клеток (зоны пролиферации) и родамином (ThermoFisher, США) для детекции мертвых клеток (зона покоя).

Анализ продукции цитокинов с помощью мультиплексного анализа. TCR-подобные CAR/CAR/TCR-T-клетки (200 тыс.) и один 3D-сфероид культивировали 24 ч. В качестве контроля использовали нетрансдуцированные Т-клетки, которые также культивировали с 3D-сфероидами. Содержание цитокинов в культуральной среде оценивали с помощью набора LEGENDplex(TM) Human CD8/NK Panel (13-plex) with Filter Plate assay (Biolegend, США) с помощью проточной цитометрии. Концентрацию образцов определяли по калибровочной кривой, построенной по величине флуоресценции стандартных образцов с помощью облачного программного обеспечения LEGENDplex™ (BioLegend от Qognit). Данные, полученные в результате анализа высвобождения цитокинов, были логарифмически (log₂) трансформированы с использованием Pandas 2.0.3. Тепловая карта продукции цитокинов была создана с использованием Bioinfokit 2.1.0 [https://zenodo.org/records/3964972].

Статистическую обработку данных выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 10.1 (GraphPad Software, США). Полученные данные проверяли на нормальность тестами Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Далее данные анализировали подходящими статистическими методами. Использованные статистические методы указаны в подписях к рисункам.

Результаты

Первым шагом нашего исследования было определение фенотипа получаемых TCR-подобных CAR/CAR/TCR-T-клеток. В данном исследовании мы применили методы анализа единичных клеток, адаптированные для данных проточной цитометрии с помощью Seurat (рис. 1А). Такой подход позволил нам выявить 7 кластеров среди TCR-T-клеток (NY-ESO-1), TCR-подобных CAR-T-клеток (MAGE-A4) и GD2-специфичных CAR-T-клеток: наивные CD4-T-клетки (CD4⁺CD62L^highCD45RA^-CD95^lowCD69^-TIM3^-PD1⁺), эффекторные CD4-T-клетки памяти (ЕМ) (CD4⁺CD62^lowCD45RA⁺CD95^highCD69^-TIM3^-PD1⁺), эффекторные CD4-T-клетки (EF) (CD4⁺CD62L^-CD45RA^-CD95⁺CD69⁺TIM3^-PD1⁺), наивные CD8-T-клетки (CD8⁺CD62L⁺CD45RA⁺CD95^-CD69^-TIM3^lowPD1^-), эффекторные CD8-T-клетки памяти (ЕМ) (CD8⁺CD62L^-CD45RA^highCD95^lowCD69^-TIM3⁺PD1^-), эффекторные CD8-Т-клетки (EF) (CD8⁺CD62L^-CD45RA^-CD95^-CD69^-TIM3⁺PD1^-), дубль-позитивные T-клетки (DP) (CD4⁺CD8⁺CD62L^-CD45RA^-CD95⁺CD69^-TIM3^-PD1^-) (рис. 1A-Г). Анализ соотношения различных кластеров Т-клеток в группе NY-ESO-1 выявил преобладание CD8-Т-клеток (~ 80 %), имеющих фенотип CD8-EM-Т-клеток (45,70 ± 8,11 %), CD8-EF-T-клеток (19,95 ± 6,83 %) и наивных CD8-Т-клеток (16,40 ± 7,89 %) (рис. 1Б-Д).

Анализ фенотипических кластеров MAGE-A4-специфичных TCR-подобных CAR-Т-клеток выявил присутствие преимущественно эффекторных CD4- и CD8-Т-клеток, включая 19,23 ± 7,62 % CD4-EM-T-клеток, 10,39 ± 4,52 % CD4-EF-Т-клеток, 21,73 ± 10,67 % CD8-EM-T-клеток, 9,16 ± 3,93 % CD8-EF-Т-клеток соответственно (см. рис. 1Б-Д). Кроме того, около четверти всей популяции MAGE-A4-специфичных Т-клеток представлено наивными CD4- и CD8-Т-клетками (рис. 1В-Д).

Анализ GD2-специфичных GAR-Т-клеток выявил преобладание кластеров эффекторных CD4- и CD8-Т-клеток (18,29 ± 5,08 % CD4-EM-Т-клеток; 12,65 ± 4,73 % CD4-EF-Т-клеток; 25,55 ± 5,34 % CD8-EM-Т-клеток и 10,99 ± 3,13 % CD8-EF-Т-клеток) (см. рис. 1Б-Д). При этом ~ 30 % от общей популяции GD2-специфичных CAR-Т-клеток имели фенотип наивных CD4- и CD8-Т-клеток (см. рис. 1Б-Д). В совокупности эти данные позволяют предположить, что ретровирусная трансдукция приводит к образованию наивных и эффекторных Т-клеток памяти. Экспрессия маркера Tim-3 представлена преимущественно на различных подгруппах CD8-Т-клеток, а PD-1 - преимущественно на различных подгруппах CD4-Т-клеток. Эффекторные Т-клетки сохраняют маркер ранней активации CD69 на протяжении всего срока культивирования.

Определение продукции цитокинов TCR-подобными CAR/CAR/TCR-T-клетками в культуре с 3D-сфероидом меланомы SK-MEL-37 показало, что транс­дуцированные клетки продуцируют достоверно более высокие уровни цитокинов и иммуноактивных молекул (ИЛ-6, ИЛ-17α, гранзима А, гранзима Б, sFasL, ИФН-γ, перфорина, гранулизина), связанных с цитотоксической активностью, по сравнению с нетрансдуцированными клетками (рис. 2A-Г).

Обсуждение

При создании генетически модифицированных Т-клеток для терапии солидных опухолей необходимо стремиться к тому, чтобы в конечном продукте преобладали стабильные клетки, способные к реализации эффекторных функций in vivo. Нами показано, что среди TCR-подобных CAR/CAR/TCR-T-клеток после трансдукции преобладают эффекторные CD4⁺- и CD8⁺-Т-клетки памяти. Следует отметить, что трансдуцированные CD8-Т-клетки экспрессируют маркер Tim-3 (см. рис. 1Г), который обычно является маркером эффекторных клеток [16]. Известно, что Tim-3 индуцирует экспрессию белкового комплекса mTORc1 [17], который у эффекторных Т-клеток играет основную модулирующую роль в активации синтеза белков с помощью протеинкиназы S6k для индукции противоопухолевых цитокинов. Этот факт свидетельствует о том, что при активации транскрипционного фактора NF-κB и RUNX1 Т-клетки адаптируются к функциональным особенностям окружающей их среды, чтобы обеспечить выживание и одновременно поддержание эффекторного фенотипа [18; 19]. Среди CD4⁺-популяций трансдуцированных Т-клеток наблюдалась выраженная экспрессия маркера PD-1 (см. рис. 1Г), что обычно характерно для ингибирования активированных CD4⁺-Т-клеток при взаимодействии с Т-регуляторными клетками и микроокружением опухоли [20]. Экспрессия PD-1 на Т-клетках обычно характерна для активированных Т-клеток и препятствует апоптозу в инфильтрирующих опухоль Т-клетках [21]. Тем не менее имеются данные о том, что экспрессия PD-1 в эффекторных Т-клетках повышает сродство к опухолевым клеткам [22, 23], что выражается в угнетении эффекторной функции в Т-клетках с продолжающейся продукцией ИФН-γ.

В активированных Т-клетках происходит анаболический метаболизм, при котором питательные вещества используются для создания молекулярных комплексов и блоков, поддерживающих клеточную пролиферацию [24]. Метаболически активные субпопуляции CD4⁺- и CD8⁺-Т-клеток имеют повышенную жизнеспособность in vivo и противоопухолевую активность [25, 26]. При совместном культивировании трансдуцированных Т-клеток со сфероидами линии SK-Mel-37 показана активная продукция ИЛ-6, ИЛ-17α, гранзима А, гранзима Б, sFasL, ИФН-γ, перфорина, гранулизина.

Значительное повышение продукции гранзимов А и Б при взаимодействии TCR-подобных CAR/CAR/TCR-T-клеток с 3D-структурой опухолевых клеток показывает, что модифицированные T-клетки достигают цитотоксического эффекта с помощью "быстродействующего" механизма экзоцитоза гранул перфорина и гранзима, которые открывают поры в плазматической мембране клетки-мишени и стимулируют апоптоз каспазозависимыми и каспазонезависимыми путями [27]. Продукция таких цитокинов, как ИЛ-2, ИЛ-6 и ИФН-γ, способствует привлечению других иммунных клеток, таких как НК-клетки, макрофаги и другие Т-клетки, для создания более эффективной среды для подавления опухоли [28]. Высокий уровень продукции цитокинов также может быть вызван тем, что при формировании 3D-сфероида экспрессия генов, участвующих в процессах, связанных с активацией белков внеклеточного матрикса, различных интегринов и воспалительных факторов, значительно отличается от классической монослойной культуры [29].

Заключение

Использование 3D-культур опухолевых клеток для изучения потенциала модифицированных Т-клеток является моделью, которая больше приближена к реальным процессам и проблемам в терапии солидных опухолей. В нашей работе показано, что Т-клетки, трансдуцированные ретровирусными векторами, направленными на различную модификацию T-клеточного рецептора для распознавания антигенов солидных опухолей (NY-ESO-1, MAGE-A4 и GD2) обладают эффекторным фенотипом, способны к цитотоксической активности, направленной против 3D-сфероида опухолевых клеток с помощью "быстродействующего" механизма экзоцитоза гранул перфорина и гранзима и привлечению других типов иммунных клеток для усиления противоопухолевого эффекта. Полученные на 3D-моделях данные в дальнейшем помогут оптимизировать методы тестирования эффективности TCR-подобных CAR/CAR/TCR-Т-клеток различной специфичности для оценки перспективности их использования в лечения пациентов с солидными опухолями и тем самым повысить универсальность подхода АКТ по лечению злокачественных новообразований.

Литература

1. Albarrán V., San Román M., Pozas J., Chamorro J., Rosero D.I., Guerrero P., Calvo J.C., González C., García de Quevedo C., Pérez de Aguado P., Moreno J., Cortés A., Soria A. Adoptive T cell therapy for solid tumors: current landscape and future challenges. Front. Immunol. 2024; 15: 1352805. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2024.1352805

2. De Marco R.C., Monzo H.J., Ojala P.M. CAR T Cell therapy: a versatile living drug. Int. J. Mol. Sci. 2023; 24 (7): 6300. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms24076300

3. Ершов А.В., Демьянов Г.В., Насруллаева Д.А., Радкевич Е.Р., Долгих В.Т., Сидорова Н.В., Валиев Т.Т., Ефимова М.М., Мачнева Е.Б., Киргизов К.И., Киселевский М.В., Манасова З.Ш. Новейшие тенденции в совершенствовании CAR-Т-клеточной терапии: от лейкозов к солидным злокачественным новообразованиям. Российский журнал детской онкологии и гематологии. 2021; 8 (2): 84-95. DOI: https://doi.org/10.21682/2311-1267-2021-8-2-84-95

4. Zhang P., Zhang G., Wan, X. Challenges and new technologies in adoptive cell therapy. J. Hematol. Oncol. 2023; 16 (1): 97. DOI: https://doi.org/10.1186/s13045-023-01492-8

5. Chen Z., Han S., Sanny A., Chan D.L., van Noort D., Lim W., Tan A.H., Park S. 3D hanging spheroid plate for high-throughput CAR T cell cytotoxicity assay. J. Nanobiotechnol. 2022; 20 (1): 30. DOI: https://doi.org/10.1186/s12951-021-01213-8

6. Ishiguro Y., Iriguchi S., Asano S., Shinohara T., Shiina S., Arima S., Kassai Y., Sakai Y., Obama K., Kaneko S. Lineage tracing of T cell differentiation from T-iPSC by 2D feeder-free culture and 3D organoid culture. Front. Immunol. 2023; 14: 1303713. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1303713

7. Alsalloum A., Alrhmoun S., Shevchenko J., Fisher M., Philippova J., Perik-Zavodskii R, Perik-Zavodskaia O., Lopatnikova J., Kurilin V., Volynets M., Akahori Y., Shiku H., Silkov A., Sennikov S. TCR-engineered lymphocytes targeting NY-ESO-1: in vitro assessment of cytotoxicity against tumors. Biomedicines. 2023; 11 (10): 2805. DOI: https://doi.org/10.3390/biomedicines11102805

8. Wang L., Matsumoto M., Akahori Y., Seo N., Shirakura K., Kato T., Katsumoto Y., Miyahara Y., Shiku H. Preclinical evaluation of a novel CAR-T therapy utilizing a scFv antibody highly specific to MAGE-A4p230-239/HLA-A*02:01 complex. Molecular Therapy. 2024; 32 (3): 734-48. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2024.01.018

9. Wang Y., Wang L., Seo N., Okumura S., Hayashi T., Akahori Y., Fujiwara H., Amaishi Y., Okamoto S., Mineno J., Tanaka Y., Kato T., Shiku H. CAR-modified Vγ9Vδ2 T Cells propagated using a novel bisphosphonate prodrug for allogeneic adoptive immunotherapy. Int. J. Mol. Sci. 2023; 24 (13): 10873. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms241310873

10. Hao Y., Stuart T., Kowalski M.H., Choudhary S., Hoffman P., Hartman A., Srivastava A., Molla G., Madad S., Fernandez-Granda C., Satija R. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat. Biotechnol. 2024; 42 (2): 293-304. DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-023-01767-y

11. Korsunsky I., Millard N., Fan J., Slowikowski K., Zhang F., Wei K., Baglaenko Y., Brenner M., Loh P.R., Raychaudhuri S. Fast, sensitive and accurate integration of single-cell data with Harmony. Nat. Methods. 2019; 16 (12): 1289-96. DOI: https://doi.org/10.1038/s41592-019-0619-0

12. Sommermeyer D., Conrad H., Krönig H., Gelfort H., Bernhard H., Uckert W. NY-ESO-1 antigen-reactive T cell receptors exhibit diverse therapeutic capability. Int. J. Cancer. 2013; 132 (6): 1360-7. DOI: https://doi.org/10.1002/ijc.27792

13. Alsalloum A., Shevchenko J., Fisher M., Philippova J., Perik-Zavodskii R., Perik-Zavodskaia O., Alrhmoun S., Lopatnikova J., Vasily K., Volynets M., Zavjalov E., Solovjeva O., Akahori Y., Shiku H., Silkov A., Sennikov S. Exploring TCR-like CAR-engineered lymphocyte cytotoxicity against MAGE-A4. Int. J. Mol. Sci. 2023; 24 (20): 15134. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms242015134

14. Tsao C.Y., Sabbatino F., Cheung N.K., Hsu J.C., Villani V., Wang X., Ferrone S. Anti-proliferative and pro-apoptotic activity of GD2 ganglioside-specific monoclonal antibody 3F8 in human melanoma cells. Oncoimmunology. 2015; 4 (8): e1023975. DOI: https://doi.org/10.1080/2162402X.2015.1023975

15. Ware M.J., Colbert K., Keshishian V., Ho J., Corr S.J., Curley S.A., Godin B. Generation of homogenous three-dimensional pancreatic cancer cell spheroids using an improved hanging drop technique. Tissue Eng. Part C Methods. 2016; 22 (4): 312-21. DOI: https://doi.org/10.1089/ten.TEC.2015.0280

16. Banerjee H., Nieves-Rosado H., Kulkarni A., Murter B., McGrath K.V., Chandran U.R., Chang A., Szymczak-Workman A.L., Vujanovic L., Delgoffe G.M., Ferris R.L., Kane L.P. Expression of Tim-3 drives phenotypic and functional changes in Treg cells in secondary lymphoid organs and the tumor microenvironment. Cell Rep. 2021; 36 (11): 109699. DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109699

17. Sabins N.C., Chornoguz O., Leander K., Kaplan F., Carter R., Kinder M., Bachman K., Verona R., Shen S., Bhargava V., Santulli-Marotto S. TIM-3 engagement promotes effector memory t cell differentiation of human antigen-specific CD8 T Cells by activating mTORC1. J. Immunol. 2017; 199 (12): 4091-2. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1701030

18. Kaech S.M., Cui W. Transcriptional control of effector and memory CD8+ T cell differentiation. Nat. Rev. Immunol. 2012; 12 (11): 749-61. DOI: https://doi.org/10.1038/nri3307

19. Hosokawa H., Rothenberg E.V. How transcription factors drive choice of the T cell fate. Nat. Rev. Immunol. 202; 21 (3): 162-76. DOI: https://doi.org/10.1038/s41577-020-00426-6

20. Mazerolles F., Rieux-Laucat F. PD-L1 is expressed on human activated naive effector CD4+ T cells. Regulation by dendritic cells and regulatory CD4+ T cells. PLoS One. 2021; 16 (11): e0260206. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0260206

21. Lu D., Ni Z., Liu X., Feng S., Dong X., Shi X., Zhai J., Mai S., Jiang J., Wang Z., Wu H., Cai K. Beyond T Cells: understanding the role of PD-1/PD-L1 in tumor-associated macrophages. J. Immunol. Res. 2019; 2019: 1919082. DOI: https://doi.org/10.1155/2019/1919082

22. Филиппова Ю.Г., Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Терещенко В.П., Фишер М.С., Курилин В.В., Пашкина Е.А., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Фенотип и эффекторные функции GD2-специфичных CAR-T-клеток in vitro. Иммунология. 2022; 43 (5): 525-35. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-525-535

23. Wachsmann T.L.A., Wouters A.K., Remst D.F.G., Hagedoorn R.S., Meeuwsen M.H., van Diest E., Leusen J., Kuball J., Falkenburg J.H.F., Heemskerk M.H.M. Comparing CAR and TCR engineered T cell performance as a function of tumor cell exposure. Oncoimmunology. 2022; 11 (1): 2033528. DOI: https://doi.org/10.1080/2162402X.2022.2033528

24. Булыгин А.С., Филиппова Ю.Г., Алсаллум А., Алрахмун С., Киреев Ф.Д., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Перик-Заводский Р.Ю., Перик-Заводская О.Ю., Назаров К.В., Шику Х., Силков А.Н., Сенников С.В. Оценка метаболизма TCR-подобных CAR/CAR/TCR-T-клеток в 3D-культуре. Иммунология. 2024; 45 (6): 691-700. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-6-691-700

25. Титов К.С., Чулкова С.В., Запиров Г.М., Лорие З.В., Киселевский М.В. Влияние опухолевого микроокружения рака молочной железы на прогноз и лечение. Российский биотерапевтический журнал. 2024; 23 (3): 10-7. DOI: https://doi.org/10.17650/1726-9784-2024-23-3-10-17

26. Golubovskaya, V., Wu L. Different Subsets of T Cells, Memory, Effector Functions, and CAR-T Immunotherapy. Cancers 2016; 8(3): 36. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers8030036

27. Benmebarek M.R., Karches C.H., Cadilha B.L., Lesch S., Endres S., Kobold S. Killing Mechanisms of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Int. J. Mol. Sci. 2019; 20 (6): 1283. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms20061283

28. Ivica N.A., Young C.M. Tracking the CAR-T revolution: analysis of clinical trials of CAR-T and TCR-T therapies for the treatment of cancer (1997-2020). Healthcare (Basel). 2021; 9 (8): 1062. DOI: https://doi.org/10.3390/healthcare9081062

29. Chang C.C., Jiang S.S., Tsai F.Y., Hsu P.J., Hsieh C.C., Wang L.T., Yen M.L., Yen B.L. Targeting conserved pathways in 3D spheroid formation of diverse cell types for translational application: enhanced functional and antioxidant capacity. Cells. 2023; 12 (16): 2050. DOI: https://doi.org/10.3390/cells12162050

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)