Изменение эффекторных функций белков γ-глобулиновой фракции и их металлокомплексов в условиях эквимолярного связывания белком А Staphylococcus aureus

• Чекнёв Сергей Борисович
• Сарычева Мария Андреевна
• Вострова Елена Ивановна
• Бабаянц Алла Артёмовна

Резюме

Введение. Специфическое связывание белка А S. aureus с Fc-фрагментом IgG человека рассматривают в контексте возможности его функционирования в качестве внеклеточного Fc-рецептора.

Цель - оценка выработки клетками крови человека ряда цитокинов в присутствии человеческого сывороточного γ-глобулина и его металлокомплексов в условиях эквимолярного связывания белком А S. aureus.

Материал и методы. Работа выполнена на клетках периферической крови человека с использованием методов препаративной биохимии и химии белка, оптико-физических и иммунохимических методов, технологий индукции выработки цитокинов.

Результаты. Белок А S. aureus в условиях эквимолярного взаимодействия с человеческим сывороточным γ-глобулином и связывания его Fc-фрагмента образует характеристический комплекс, снижая вследствие этого индукционную активность γ-глобулина в отношении выработки клетками крови человека ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНОα и ИЛ-10. Образование металлокомплексов γ-глобулина меняет компактность пространственной упаковки белковой глобулы, в результате чего связывание лиганда белком А S. aureus частично утрачивает свою эффективность.

Заключение. Образование металлокомплексов γ-глобулина создает препятствия его эквимолярному связыванию белком А S. aureus и снижает эффект блокирования в механизмах индукции выработки цитокинов, запускаемой взаимодействием Fc-рецепторов клетки со специфическим лигандом.

Ключевые слова: γ-глобулины; металлокомплексы; белок А S. aureus; связывание; Fc-рецепторы; цитокины

Введение

Специфическое связывание белка А Staphylococcus aureus c Fc-фрагментом IgG человека рассматривают не только как механизм, способствующий ускользанию бактерий от иммунного надзора макроорганизма, но и в контексте возможности функционирования белка А S. aureus в качестве внеклеточного Fc-рецептора (FcR), способного связывать до двух или четырех молекул IgG- или IgM-антител, препятствовать их взаимодействию с поверхностью клетки, блокируя запуск внутриклеточных сигнальных путей, активируемых мембранными FcR [1-3].

Связанные по своему Fc-фрагменту белком А S. aureus антитела утрачивают способность активировать комплемент по классическому пути [2]. В этих условиях фагоцитоз S. aureus не реализуется [3], активность эндоцитоза, как и уровень реакций антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности и выработки воспалительных медиаторов, существенно снижается [4-6], процессы презентации антигенов и выработки В-клетками антител ослабевают [5, 6].

Поскольку активирующие FcγRIA, в силу высокой аффинности связывания мономерных IgG, могут быть насыщаемы лигандами в физиологических условиях [6], понятно, что взаимодействие IgG с белком А S. aureus, значительная часть которого, как известно, в логарифмической и стационарной фазах роста культуры высвобождается во внешнюю по отношению к клетке среду [7-9], может создавать дополнительные ограничения индукции иммунного ответа, замкнутого на активацию FcR клеток [1-3].

Вместе с тем работами последнего времени установлено, что белки γ-глобулиновой фракции плазмы крови человека в физиологических условиях могут циркулировать в виде металлокомплексов [10], естественное образование которых сопряжено с конформационными преобразованиями в области Fc-фрагмента молекулы [10]. Структурные характеристики последнего во многом определяют эффективность связывания лиганда с клеточными FcR [10]. При этом выраженность ответа клетки, запускаемого активированными FcR в условиях связывания металлокомплексов γ-глобулина, подлежит металлоспецифическим изменениям в сравнении с действием контрольных белков [10, 11]. В результате такой индукции в микроокружении клетки формируется новый цитокиновый профиль, специфически определяемый взаимодействующим с γ-глобулином и структурно перестраивающим его Fc-фрагмент катионом [10, 11].

Очевидно, что связывание белка А S. aureus с γ-глобулинами, трансформированными присоединением катионов металлов, будет реализоваться иными закономерностями, нежели в условиях его связывания с контрольными белками, и по-иному влиять на совокупность клеточных ответов, зависимых от динамики лиганд-рецепторного взаимодействия.

Цель работы - оценка выработки клетками периферической крови (КПК) человека ряда воспалительных медиаторов в присутствии человеческого сывороточного γ-глобулина и его металлокомплексов, образованных с катионами меди и цинка, в условиях эквимолярного связывания белком А S. aureus.

Общий дизайн исследования предполагал получение металлокомплексов человеческого сывороточного γ-глобулина, образованных с катионами меди и цинка, с определением количества связавшегося с белком металла и оценкой конформационного состояния белка в растворе; связывание γ-глобулина и его металлокомплексов с эквимолярным количеством белка А S. aureus (контроль специфичности - бычий сывороточный альбумин, БСА) с оценкой конформационного состояния белков в растворе; индукцию выработки КПК человека ряда иммуноактивных цитокинов в присутствии указанных выше белков и их металлокомплексов; определение содержания индуцированных в культуре КПК человека цитокинов методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Материал и методы

Образцы для исследования. Образцы крови здоровых доноров в объеме одной пробы предоставлялись в рамках действовавшего договора с Московской городской станцией переливания крови, ныне - ГБУЗ Центр крови им. О.К. Гаврилова Департамента здравоохранения города Москвы.

Лабораторные исследования. Индукцию цитокинов в суспензиях клеток, полученных разведением проб цельной периферической венозной крови человека (10⁶ клеток в 1 мл), проводили в полной питательной среде, приготовленной на основе среды RPMI-1640 ("ПанЭко", Россия), дополненной 2 % плазмы донорской крови, L-глутамином (из комплекта к флакону среды), гентамицином (20 ЕД/мл) и гепарином (до 5,0 ЕД/мл), в течение 24, 48 или 72 ч при 37 ºС во влажной атмосфере, содержавшей 5 % СО₂. Использовали пластиковые плоскодонные 24-луночные планшеты (Costar, США).

Образцы трансформированного связыванием катионов меди или цинка человеческого сывороточного γ-глобулина (исходный препарат - ICN) применяли в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Параллельно оценивали действие контрольных препаратов γ-глобулина и солевых растворов меди (CuSO₄ - 5H₂O, Merck, Германия) и цинка (ZnCl₂, Chemapol, Польша). Содержание катионов в них соответствовало количеству металла, связавшегося с белком на стадии получения экспериментальных образцов: меди - 2,2 нг/мл, цинка - 1,0 нг/ мл. Образцы поддерживали в 0,15 М растворе NaCl (pH 7,21-7,30).

В качестве контрольных по меди и цинку использовали γ-глобулины, приготовленные из той же порции белка, что и соответствующие опытные (трансформированные), прошедшие все те же стадии обработки, но не содержавшие в растворе солей меди или цинка. Растворы контрольных белков дополняли по объему необходимым количеством 0,15 М NaCl.

Контрольные образцы белка А S. aureus (Sigma, США), взаимодействующего с человеческим сывороточным γ-глобулином в 0,15 М растворе NaCl (рН 7,16-7,23), применяли в конечной концентрации 0,14 мкг/ мл, подобранной для получения эквимолярного соотношения белков в условиях образования комплекса в растворе.

Для проведения эквимолярного связывания белка А S. aureus с человеческим сывороточным γ-глобулином 100 мкг/мл γ-глобулина инкубировали с 28 мкг/мл белка А S. aureus. Здесь и далее по тексту концентрации приводятся по навескам взаимодействующих белков. С учетом серии последующих препаративных разведений образцов соответствующие концентрации белков в культуре КПК человека составляли 0,5 и 0,14 мкг/ мл. Связывание проводили в течение 30 мин при 37 °С в стеклянных центрифужных пробирках с тщательным, но аккуратным перемешиванием каждые 10 мин.

Приготовление и внесение образцов человеческого сывороточного γ-глобулина, специфически связанного белком А S. aureus, в культуру КПК человека осуществляли, ориентируясь на концентрацию в образце γ-глобулина. В контрольную суспензию КПК человека вносили необходимое количество 0,15 М раствора NaCl.

Стандартными индукторами выработки цитокинов служили: вирус болезни Ньюкасла (ВБН) в дозе 10 ЦПД (цитопатических доз) на клетку и фитогемагглютинин Р (ФГА, Difco, Испания, 1,0 мкг/мл).

Содержание ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНОα и ИЛ-10 в супернатантах индуцированных КПК определяли методом ИФА с использованием микропланшетного спектрофотометра "Epoch" (BioTek, США). Наборы для ИФА (ЗАО "Вектор-Бест", Россия) применяли согласно инструкции фирмы-производителя, с дополнительными технологическими контролями.

Каждый образец полученных супернатантов тестировали в двух различных разведениях исходного материала, приготовленных с использованием питательной среды RPMI-1640 (Gibco, США). Каждое разведение каждого образца и всех использованных контролей экспериментальной системы (ВБН, ФГА, спонтанная продукция цитокинов КПК) тестировали не менее чем в двух параллельных лунках микропланшетов. В работе представлены результаты, полученные применением следующих разведений образцов индуцированных цитокинов: ИЛ-1β - 1/10, ИЛ-6 - 1/50, ФНОα - 1/2, ИЛ-10 - неразведенный образец.

Для подтверждения специфичности связывания человеческого сывороточного γ-глобулина белком А S. aureus и образования эквимолярного комплекса проводили спектрофотометрическое исследование взаимодействия белков в 0,15 М растворе NaCl (рН 7,09-7,23) или в дистиллированной воде (рН 6,24-6,50). Спектры поглощения получали в ультрафиолете (УФ-свете) в диапазоне длин волн от 190 до 320 нм, в автоматическом режиме, с шагом 0,1 нм, с использованием дифференцирующего спектрофотометра "Shimadzu UV-1800" (Япония).

С целью учета возможности реализации в ходе образования и изучения искомых комплексов человеческого сывороточного γ-глобулина, в том числе трансформированного связыванием катионов меди и цинка, с белком А S. aureus эффектов неспецифического белок-белкового взаимодействия, экспериментальную часть исследования в культуре КПК человека, а также спектрофотометрический анализ сопровождали оценкой образцов человеческого сывороточного γ-глобулина, дополненных в условиях, аналогичных образованию специфического комплекса, эквимолярными количествами БСА (ДиаМ, Россия). Концентрация БСА в 0,15 М растворе NaCl (рН 7,09-7,23) на этапе взаимодействия со 100 мкг/мл γ-глобулина составляла 44 мкг/мл, а в культуре КПК человека - 0,22 мкг/мл. Все препаративные манипуляции с γ-глобулином, взаимодействующим с БСА, проводили в полном соответствии с техникой получения специфического эквимолярного комплекса (см. выше).

Кислотность растворов контролировали с помощью базового электронного рН-метра "Sartorius PB-11" (Германия), укомплектованного электродом Sartorius PY-P11.

Для осветления растворов и стерилизации образцов в ходе клеточной работы применяли мембранную фильтрацию с использованием фильтрующих насадок Millex для водно-солевых растворов или белковых фильтрующих насадок Millex с диаметром пор 0,22 или 0,45 мкм (Millipore, США) соответственно. При работе с белками в ходе спектрофотометрического исследования применяли последовательную мембранную фильтрацию с использованием белковых насадок Millex с диаметром пор 0,45 мкм, затем - 0,22 мкм (Millipore, США).

Металлокомплексы человеческого сывороточного γ-глобулина, образованные с катионами меди и цинка, получали по методике, подробно описанной в работе [12]. Препараты человеческого сывороточного γ-глобулина, освобожденные мембранной фильтрацией (0,45 мкм) от крупных ассоциатов белка, инкубировали с водным сульфатом меди или хлоридом цинка в течение 1 ч при 37 °С. По истечении срока инкубации образцы белков двукратно подвергали молекулярной ультрафильтрации в ячейках Ultracel-30k (Millipore, США) в режиме 1700 g, 5 мин, с умеренным охлаждением.

Супернатанты с белками поднимали из ячеек, восстанавливали в исходном объеме и использовали в дальнейшей работе. Количество связавшегося с γ-глобулином металла определяли, исходя из содержания свободных катионов в фильтрате, которое оценивали с использованием фотометрии реакций комплексообразования: меди - с диэтилдитиокарбаматом натрия при длине волны 440 нм, цинка - с о-фенантролином при длине волны 226 нм. Все этапы получения металлокомплексов сопровождали оценкой конформационного состояния белков в растворе. Реальную концентрацию белков и молярные отношения в растворе рассчитывали на основании результатов фотометрического исследования образцов при длине волны 280 нм. Полученные и использованные в исследовании комплексы содержали 11 катионов меди и 6 катионов цинка на молекулу белка.

Статистическая обработка. При математической обработке результатов достоверность различия средних величин устанавливали с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты

Как и в наших более ранних исследованиях [13], образование металлокомплекса γ-глобулина с катионами меди в 1,56 раза (р < 0,01) снижает выработку ИЛ-1β, индуцируемую исходным белком (рис. 1).

Связывающий Fc-фрагмент γ-глобулина белок А S. aureus ослабляет индуцирующее КПК воздействие γ-глобулина на 35,2 %, или в 1,55 раза (р < 0,01), тогда как индукция выработки ИЛ-1β металлокомплексом γ-глобулина с катионами меди в условиях связывания белком А S. aureus снижается на 21,9 %, или в 1,26 раза (р < 0,01).

В опытах с катионами цинка белок А S. aureus не проявляет специфических свойств, не связывает с очевидностью конформационно более жесткий Fc-фрагмент металлокомплекса и лишь на 9,42 %, или в 1,1 раза (р > 0,1), ослабляет выработку ИЛ-1β, регистрируемую в присутствии контрольного металлокомплекса. Следовательно, эффективность связывания Fc-фрагмента γ-глобулина белком А S. aureus во многом определяется пластичностью Fc-фрагмента, значительно повышающейся в условиях вызываемой катионами меди частичной дестабилизации региона, сопровождающейся расщеплением некоторых боковых аминокислотных радикалов [10].

Как и в наших более ранних исследованиях [14], образование металлокомплекса γ-глобулина с катионами меди в 2,08 раза (р < 0,001) снижает выработку ИЛ-6, индуцируемую исходным белком (рис. 2).

Связывающий Fc-фрагмент γ-глобулина белок А S. aureus ослабляет индуцирующее КПК воздействие γ-глобулина на 39,9 %, или в 1,66 раза (р < 0,001), в то время как индукция выработки ИЛ-6 металлокомплексом γ-глобулина с катионами меди в условиях связывания белком А S. aureus не снижается, а даже на 20,14 %, или в 1,2 раза (р < 0,001), усиливается и обеспечивает выработку ИЛ-6 КПК человека на уровне, в известном алгоритме сравнения сопоставимом с эффектами белка А S. aureus, связавшего Fc-фрагмент контрольного γ-глобулина (рис. 2).

Аналогично выработке ИЛ-1β (см. выше), в опытах с катионами цинка белок А S. aureus не проявляет специфических свойств и не связывает с очевидностью конформационно более жесткий Fc-фрагмент металлокомплекса. При этом, в отличие от индукции ИЛ-1β, он не ослабляет, а усиливает на 7,18 %, или в 1,07 раза (р < 0,02), продукцию ИЛ-6, регистрируемую в присутствии контрольного металлокомплекса. Выработка ИЛ-6, индуцированная связавшим белок А S. aureus γ-глобулином, увеличивается на 5,95 %, или в 1,06 раза (р < 0,1), по сравнению с исходным γ-глобулином. Результат подтверждает потребность в известной степени пластичности Fc-фрагмента молекул антител для реализации эффекта блокирования лиганд-рецепторного взаимодействия специфическим связыванием γ-глобулина белком А S. aureus (см. выше).

Связывающий Fc-фрагмент γ-глобулина белок А S. aureus ослабляет индукцию выработки КПК человека ФНОα в присутствии контрольного γ-глобулина на 20,4 %, или в 1,26 раза (р < 0,02), тогда как индуцирующее воздействие металлокомплекса человеческого сывороточного γ-глобулина, образованного с катионами меди, в условиях связывания белком А S. aureus снижается лишь на 9,1 %, или в 1,1 раза (р > 0,1).

В опытах с катионами цинка белок А S. aureus, связывающий металлокомплекс γ-глобулина, снижает индукционные эффекты в отношении выработки КПК человека ФНОα на 14,5 %, или в 1,17 раза (р < 0,1), по сравнению с контрольным металлокомплексом, в то время как продукция медиатора, индуцированная собственно человеческим сывороточным γ-глобулином, в присутствии белка А S. aureus ослабляется на 20,42 %, или в 1,26 раза (р < 0,02).

Сказанное обнаруживает способность белка А S. aureus связывать не только конформационно пластичные (см. выше), но и структурно более жесткие Fc-фрагменты молекул антител, что может существенно влиять на активность индукционных процессов, контролируемых металлокомплексами человеческого сывороточного γ-глобулина, образованными с катионами цинка, посредством лиганд-рецепторных взаимодействий.

Как и в наших более ранних исследованиях [15], образование металлокомплекса γ-глобулина с катионами цинка в 1,26 раза (р < 0,05) усиливает выработку ИЛ-10, индуцируемую исходным белком (рис. 3).

Связывающий Fc-фрагмент γ-глобулина белок А S. aureus ослабляет индуцирующее КПК воздействие γ-глобулина на 29,7 %, или в 1,42 раза (р < 0,001), в то время как индукция выработки ИЛ-10 металлокомплексом γ-глобулина с катионами цинка в условиях связывания белком А S. aureus снижается лишь на 11,83 %, или в 1,13 раза (р > 0,1; см. рис. 3).

В опытах с катионами меди белок А S. aureus, связывающий металлокомплекс γ-глобулина, наоборот, снижает индуцирующие эффекты в отношении выработки КПК человека ИЛ-10 на 26,49 %, или в 1,36 раза (р < 0,001), тогда как продукция цитокина, индуцированная человеческим сывороточным γ-глобулином, в присутствии белка А S. aureus ослабляется на 21,35 %, или в 1,27 раза (р < 0,001).

Катионы меди оказываются способны не только частично дестабилизировать боковые аминокислотные радикалы Fc-фрагментов молекул антител, но и существенно влиять на компактность пространственной упаковки структур образующегося комплекса γ-глобулина, связывающего медь, с белком А S. aureus и значимо изменять динамику лиганд-рецепторных взаимодействий, запускающих внутриклеточные механизмы выработки ИЛ-10.

Совершенно по-другому видятся результаты контрольных экспериментов с БСА, реализованных с целью исключения сколь-нибудь существенного вклада неспецифических белок-белковых взаимодействий в регистрируемые эффекты белка А S. aureus.

БСА выступает независимым от γ-глобулина индуктором выработки иммуноактивных цитокинов КПК человека. В его присутствии выработка ИЛ-1β возрастает в 1,16 раза, или на 15,6 % (р < 0,05), продукция ФНОα увеличивается в 1,52 раза, или на 51,67 % (р < 0,001), содержание в культуральной жидкости КПК человека ИЛ-10 повышается в 1,15 раза, или на 14,92 % (р < 0,02). Наличие у БСА собственных механизмов регуляции клеточной активности подтверждается снижением в его присутствии в 1,14 раза, или на 12,14 % (р < 0,001), выработки КПК человека ИЛ-6.

В отличие от белка А S. aureus, комбинирование γ-глобулина с БСА приводит к усилению индуцирующего воздействия исходного белка в 1,7 раза, или на 70,41 % (р < 0,001), в условиях выработки ИЛ-1β и в 1,36 раза, или на 36,14 % (р < 0,001), в условиях продукции ИЛ-10. Одновременно индукция выработки ИЛ-10 модифицированным катионами меди γ-глобулином в присутствии БСА усиливается в 1,5 раза, или на 50,1 % (р < 0,001), в то время как продукция КПК человека ИЛ-1β, индуцированная γ-глобулином, связавшим катионы меди, аналогично эффекту белка А S. aureus, в присутствии БСА ослабляется в 1,27 раза, или на 21,2 % (р < 0,001).

Принципиальные различия в действии белка А S. aureus и БСА на активность КПК человека подтверждают специфичность эффектов первого, с одной стороны, и минимальный вклад неспецифических белок-белковых взаимодействий в реализацию его связывания со специфическим лигандом - с другой.

Очевидно при этом, что специфичность эффектов белка А S. aureus определяется его способностью характеристически связывать Fc-фрагмент человеческого сывороточного γ-глобулина и известной топикой реакции, формирующей в растворе эквимолярный комплекс, достоверно описываемый оптико-физическими методами исследования.

Как показано на рис. 4, в ближнем УФ-свете комплекс проявляется в виде белковых агрегатов приростом поглощения при длине волны 320 нм на 0,135-0,138 единиц оптической плотности (ед. опт. пл.) по сравнению с исходными белками. Комплекс обладает существенно развернутой во внемолекулярное пространство шарнирной областью с выраженным приростом поглощения в диапазоне длин волн 240-260 нм. Разница с исходным γ-глобулином при длине волны 250 нм составляет 0,309 ед. опт. пл. (рис. 4).

Комплекс обладает показательным длинноволновым белковым пиком: при длине волны 280 нм поглощение исходного γ-глобулина составляет 0,189 ед. опт. пл., белка А S. aureus - 0,061 ед. опт. пл., комплекса - 0,384 ед. опт. пл., что в 2,03 раза больше исходного γ-глобулина и в 1,54 раза больше показателя, который должен был бы характеризовать независимое поглощение УФ-света смешанными и не взаимодействующими друг с другом белками (0,250 ед. опт. пл.; см. рис. 4).

При этом в процессе образования комплекса на фоне существенной конформационной перестройки белковых молекул, формируемый биополимер сохраняет особенности обоих взаимодействующих белков: максимум поглощения белка А S. aureus, определяемый при длине волны 275 нм [16] и обусловленный наличием в составе его первичной последовательности четырех аминокислотных остатков тирозина, и заметную гипсохромию (сдвиг дифференциального УФ-спектра в область коротких волн), возникающую как результат перемещения гидрофобных хромофоров шарнирной области γ-глобулина (прежде всего неполярных аминокислотных остатков фенилаланина) из гидрофобной среды в белковой матрице в водную или солевую среду раствора (см. далее).

Таких тенденций не обнаруживается при анализе спектров поглощения, полученных при комбинировании γ-глобулина с БСА. Как видно на рис. 5, в ближнем УФ-свете указаний на образование белковых агрегатов не определяется - прирост поглощения при длине волны 320 нм составляет всего 0,005 ед. опт. пл. При длине волны 280 нм поглощение исходного γ-глобулина составляет 0,192 ед. опт. пл., БСА - 0,095 ед. опт. пл., их композиции в растворе - 0,228 ед. опт. пл., что свидетельствует практически об отсутствии взаимодействия - величины поглощения складываются в сумму, получаемую от изолированных белков (см. рис. 5). Дифференциальный спектр аналогично не устанавливает качественных различий в поглощении УФ-света между присутствующими в растворе γ-глобулином и БСА, комбинированными с целью описания их взаимодействия, и исходным γ-глобулином (рис. 6). Образования комплекса в растворе не происходит.

Обсуждение

Работами двух последних десятилетий обоснована совокупность концептуальных положений, позволяющая рассматривать биохимические процессы, замкнутые на транспорт и обмен в микроокружении клетки катионов металлов и вовлекающие белки γ-глобулиновой фракции в качестве транслирующих биомакромолекул, с позиций формирования механизма рационального ограничения воспалительных реакций и иммуногенеза [10, 11]. Наряду с поддержанием определенной напряженности клеточного иммунитета этот механизм тремя уровнями организации функциональных взаимосвязей исключает возможность повреждения собственных неизмененных клеток организма в условиях индукции аутореактивности [17].

В ходе исследований получены данные, свидетельствующие о том, что в условиях нормального физиологического обмена, первичного тканевого повреждения, воспаления или форсированной нагрузки белки γ-глобулиновой фракции плазмы крови хелатируют из периглобулярного пространства катионы металлов и претерпевают вследствие этого конформационные преобразования, преимущественно затрагивающие структуры их Fc-фрагмента [10]. В результате таких преобразований меняется динамика взаимодействия γ-глобулинов с FcR, экспрессированными на поверхности клеток иммунной системы, возникают изменения внутриклеточной сигнализации, замкнутой на активацию FcR, и клеточных ответов, запускаемых сигнальной трансдукцией, индуцируемой FcR [10, 11].

Понятно, что речь идет о металлоспецифичес­ких конформационных преобразованиях и обретении γ-глобулинами в результате связывания катионов металлов новых эффекторных свойств, которые реализуются посредством взаимодействия с FcR клеток тоже металлоспецифически [10]. При этом речь идет как о регуляторном балансе базальных уровней клеточной активности, так и об отвечаемости системного характера, масштабных реакциях обеспечения и контроля воспалительных процессов в организме [10, 11, 17].

Логика построения комплекса обобщенных в работах [10, 11, 17] исследований, представляющих биологию воспаления с позиций исключения возможности срыва толерантности и выхода реакций на аутоагрессию, исходила из ключевого положения о том, что трансляцию конформационных преобразований γ-глобулинов, происходящих в микроокружении клетки, во внутриклеточные сигнальные пути опосредуют FcR, а изменение внутриклеточных индукционных процессов, замкнутых на активацию FcR, возникает как следствие меняющейся трансдукции сигналов, запускаемых FcR в режиме иной, нежели в контроле, динамики лиганд-рецепторного взаимодействия.

Для подтверждения этого положения прямыми экспериментами можно было бы попытаться подобрать подходы к блокированию FcR с последующей оценкой изменений клеточной активности в культурах клеток-продуцентов, индуцируемых к выработке иммунорегуляторных цитокинов воздействием на FcR специфического лиганда.

Мы использовали в работе альтернативную систему оценки с применением блокирования не FcR клетки, а Fc-фрагмента γ-глобулина, рассчитывая на получение эффектов, сопоставимых с блокированием FcR, но одновременно допуская, что некоторая часть распределенных по поверхности клетки FcR с достаточной вероятностью при этом может оставаться свободной для случайного события взаимодействия со специфическим лигандом.

Для специфического связывания Fc-фрагмента γ-глобулина применяли его экспозицию с эквимолярным количеством белка А S. aureus, обладающего частичной внутренней неупорядоченностью, структурно-функциональной пластичностью и выполняющего функции внеклеточного FcR, способного связывать до двух или четырех молекул IgG- либо IgM-антител [1-3].

Как показывают результаты проведенного исследования, выступающий в качестве внеклеточного FcR белок А S. aureus в условиях эквимолярного взаимодействия с человеческим сывороточным γ-глобулином связывает Fc-фрагмент последнего, образуя характеристический комплекс (см. рис. 4-6) и снижая вследствие этого индукционную активность γ-глобулина в отношении выработки КПК человека ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНОα и ИЛ-10 в 1,26-1,66 раза (см. рис. 1-3). Следовательно, не вызывает сомнений, что в использованной экспериментальной системе значительная часть этих цитокинов индуцируется сигнальной трансдукцией, запускаемой посредством активированных FcR.

Образование металлокомплексов γ-глобулина, обретающих в результате конформационных преобразований преимущественно Fc-фрагмента новые эффекторные свойства в контроле цитокиновой регуляторной сети [10, 11], сообщает молекулам белка совокупность структурных перестроек Fc-фрагмента, меняющую компактность пространственной упаковки и, очевидно, жесткость каркаса глобулы, в силу чего связывание лиганда белком А S. aureus частично утрачивает свою эффективность. В условиях связывания металлокомплексов белок А S. aureus снижает их индукционную активность в отношении выработки КПК человека ИЛ-1β в 1,26 раза (см. рис. 1), ФНОα лишь в 1,1 раза и ИЛ-10 в 1,13 раза (см. рис. 3).

Заключение

Обобщая полученные данные, можно заключить, что представленные в работах [10, 11, 17] новые взгляды на роль белков γ-глобулиновой фракции плазмы крови, хелатирующих катионы металлов, в физиологической иммунорегуляции, поддержании определенного уровня напряженности клеточного иммунитета, контроле и рациональном ограничении воспалительных реакций обретают доказательную основу в виде специфического связывания Fc-фрагмента человеческого сывороточного γ-глобулина с FcR клеток иммунной системы, транслирующего во внутриклеточные сигнальные пути и запускаемую активированными FcR сигнальную трансдукцию конформационные преобразования белков γ-глобулиновой фракции, происходящие в примембранном пространственном микроокружении клетки.

Благодарность. Авторы выражают признательность В.С. Бутаевой за помощь, оказанную при подготовке рукописи к печати.

Литература

1. Тотолян А.А., Бурова Л.А. Fc-рецепторные белки Streptococcus pyogenes и патогенез постинфекционных осложнений. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2014; (3): 78-90. PMID: 25286515

2. Foster T.J., Geoghegan J.A., Ganesh V.K., Höök M. Adhesion, invasion and evasion: the many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus. Nature Rev. Microbiol. 2014; 12: 49-62. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro3161

3. O’Halloran D.P., Wynne K., Geoghegan J.A. Protein A is released into the Staphylococcus aureus culture supernatant with an unprocessed sorting signal. Infect. Immunity. 2015; 83 (4): 1598-609. DOI: https://doi.org/10.1128/iai.03122-14

4. Peres A.G., Stegen C., Li J., Xu A.Q., Levast B., Surette M.G., Cousineau B., Desrosiers M., Madrenas J. Uncoupling of pro- and anti-inflammatory properties of Staphylococcus aureus. Infect. Immunity. 2015; 83 (4): 1587-97. DOI: https://doi.org/10.1128/iai.02832-14

5. Sondermann P., Oosthuizen V. The structure of Fc receptor/Ig complexes: considerations of stoichiometry and potential inhibitors. Immunol. Lett. 2002; 82 (1-2): 51-6. DOI: https://doi.org/10.1016/S0165-2478(02)00018-4

6. Boross P., van de Poel K., Van de Winkel J.C.J., Leusen J.H.W. Fc receptors. In: Encyclopedia of Life Sciences. Chichester, John Wiley & Sons, 2008. DOI: https://doi.org/10.1002/978047001 5902.a0000916.pub2

7. Sjöquist J., Meloun B., Hjelm H. Protein A isolated from Staphylococcus aureus after digestion with lysostaphin. Eur. J. Biochem. 1972; 29 (3): 572-8. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1972.tb02023.x

8. Акатов А.К., Зуева В.С. Стафилококки. Москва : Медицина, 1983. 256 с.

9. Jiraviriyakul A. Detection of Staphylococcal protein A (SpA) in culture medium for developing sortase inhibitor screening method. Int. J. Pharm. Biol. Sci. 2012; 2 (1): 218-24.

10. Чекнёв С.Б. Белки γ-глобулиновой фракции, хелатирующие катионы металлов, в физиологической иммунорегуляции. Оппозитные эффекты меди и цинка. Иммунология. 2021; 42 (3): 293-300. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-3-293-300

11. Чекнёв С.Б. Белки γ-глобулиновой фракции, хелатирующие катионы металлов, в физиологической иммунорегуляции. Сонаправленное действие меди и цинка. Иммунология. 2021; 42 (5): 546-51. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-5-546-551

12. Cheknev S.B., Apresova M.A., Moryakova N.A., Efremova I.E., Mezdrokhina A.S., Piskovskaya L.S., Babajanz A.A. Production of the growth factors GM-CSF, G-CSF and VEGF by human peripheral blood cells induced with metal complexes of human serum γ-globulin formed with copper or zinc ions. Mediators of Inflammation. 2014; 2014: Article ID 518625, 8 pages. DOI: https://doi.org/10.1155/2014/518625

13. Чекнёв С.Б., Ефремова И.Е., Писковская Л.С., Юшковец Е.Н., Бабаянц А.А. Выработка раннего ИЛ-1β, индуцированного металлокомплексами человеческого сывороточного γ-глобулина. Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 2012; 154 (9): 326-9.

14. Чекнёв С.Б., Ефремова И.Е., Мездрохина А.С., Бабаянц А.А. Оценка выработки IL-6 клетками крови человека в присутствии металлокомплексов γ-глобулина. Мед. иммунология. 2012; 14 (6): 483-8.

15. Чекнёв С.Б., Апресова М.А., Ефремова И.Е., Писковская Л.С., Бабаянц А.А. Участие металлокомплексов γ-глобулина в регуляции выработки ИЛ-10. Иммунология. 2013; 34 (4): 189-93.

16. Чекнёв С.Б., Вострова Е.И., Сарычева М.А., Ефремова И.Е., Бабаянц А.А. Белок А Staphylococcus aureus как фактор, участвующий в обмене катионов металлов и способствующий формированию противовоспалительного микроокружения бактерий. Иммунология. 2018; 39 (2-3): 128-33. DOI: https://doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-2-3-128-133

17. Чекнёв С.Б. Белки γ-глобулиновой фракции, хелатирующие катионы металлов, в физиологической иммунорегуляции. Поляризация ответов и рациональное ограничение воспалительных реакций. Иммунология. 2022; 43 (4): 468-76. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-468-476

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)