Влияние макрофагов эндометрия на продукцию коллагена лейомиоцитами в эксперименте in vitro

• Сотникова Наталья Юрьевна
• Малышкина Анна Ивановна
• Воронин Дмитрий Николаевич

Резюме

Введение. Фиброз ткани считается элементом не только репарации, но и многих патологий, в частности лейомиомы матки, ввиду чего одним из актуальных векторов исследования является уточнение механизма регуляция макрофагами процесса фиброзирования.

Цель исследования - оценить влияние эндометриальных макрофагов на синтез и продукцию коллагена в первичной культуре аутологичных лейомиоцитов.

Материал и методы. В исследовании принимали участие 25 женщин репродуктивного возраста с симптомной интрамуральной лейомиомой матки. Методом иммуноферментного анализа оценивали концентрацию коллагена в супернатантах 24- и 72-часовых культур миофибробластов, сокультивированных с аутологичными макрофагами эндометрия. Уровень мРНК Col 1A1 оценивали методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени.

Результаты. Под влиянием аутологичных эндометриальных макрофагов снижалась продукция коллагена в 24- и 72-часовых культурах миофибробластов миоматозного узла. Однако повышение продукции и синтеза коллагена на 3-и сутки инкубации под влиянием макрофагов позволяет предположить, что эффект угнетения носит временный характер и напрямую связан с регуляцией активности макрофагов.

Заключение. Эндометриальные макрофаги способны подавлять синтез и продукцию коллагена I типа миофибробластами миоматозного узла.

Ключевые слова: лейомиома матки; макрофаги; миофибробласты; коллаген

Введение

Фиброз может затрагивать любые органы, приводя к нарушениям в их работе, ввиду чего его связывают почти с половиной причин смерти в индустриально развитых странах [1]. Накопление компонентов внеклеточного матрикса происходит при работе фибробластов и контролируется широким комплексом различных элементов: ростовыми факторами, гормонами, металлопротеиназами, межклеточными контактами, экзосомами [2]. Лейомиома матки характеризуется массивной выработкой коллагена за счет процессов восстановления, происходящих на уровне миометрия, а следовательно, она представляет собой ценную модель для исследования самоорганизации коллагена при патологическом состоянии [3].

Хотя коллаген традиционно рассматривался как пассивный барьер, результаты исследований последних лет показывают, что он сам является одним из факторов регуляции множества процессов в тканях [4, 5]. Биохимические и биофизические сигнальные свойства внеклеточного матрикса и коллагена в частности влияют на адгезию и миграцию клеток, морфогенез и репарацию тканей, а также на ангиогенез и опухолевые процессы. Накопление коллагена в микроокружении опухоли приводит к стимулированию механорецепторов, которые присутствуют как на опухолевых, так и на стромальных клетках, что запускает каскад биологических событий, который может как подавлять пролиферацию опухолевых клеток, так и способствовать прогрессии опухоли [4].

Тканевые макрофаги являются одними из основных регуляторов ремоделирования и репарации тканей [6]. Они способны поддерживать воспаление, но также, ограничивая силу и длительность воспалительного процесса, помогают направить реакцию иммунокомпетентных клеток на восстановление поврежденных тканей [7]. Популяция макрофагальных клеток не является однородной. Их особенности функционирования и, соответственно, фенотип напрямую зависят от их происхождения, органов и тканей, которые они инфильтрируют.

Важный вклад макрофагов в развитие фиброза показан на множестве экспериментальных моделей фиброза легких. Определенные взаимосвязи между особенностями дифференцировки макрофагов и заболеванием обнаружены и у пациентов с идиопатическим фиброзом легких [7].

Специфическая популяция макрофагов, ассоциированных с рубцами, связана с фиброзом разных тканей. Изучение популяции фиброгенных макрофагов обеспечивает стратегию объективного выявления, сортировки и доклинической проверки терапевтических мишеней для лечения заболеваний, связанных с нарушением регуляции фиброгенеза [2, 8]. Большое количество элементов, включенных в тонкий контроль накопления и лизиса внеклеточных компонентов в различных тканях и органах, затрудняет построение единой картины патогенеза фиброза [8, 12]. Также дискутабельными и требующими дальнейших исследований остаются данные о функционировании и дифференцировке макрофагов с про- и антифиброгенной активностью [7-12]. В качестве одного из основных механизмов контроля продукции коллагена большой интерес представляет взаимодействие макрофагов с миофиброластами в патогенезе миомы матки.

Учитывая все вышесказанное, мы оценили влияние аутологичных эндометриальных макрофагов на синтез и продукцию коллагена I типа миофибробластами миоматозного узла.

Материал и методы

Характеристика пациентов. Исследование проводили на базе ФГБУ "ИвНИИ МиД им. В.Н. Городкова" Минздрава России. Материал для проведения исследований был получен от 25 женщин в возрасте 20-45 лет с симптомной интрамуральной лейомиомой матки, подписавших информированное согласие. Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации "Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека" (WMA Declaration of Helsinki - Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects, 2013), Протоколом Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине (1999 г.) и действующими в Российской Федерации нормативными документами, регламентирующими порядок проведения исследований с привлечением добровольцев. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом (протокол № 3 от 27.11.2017).

Выделение клеток. Аутологичные макрофаги были получены бесферментативным механическим способом из эндометрия, забранного в проекции миоматозного узла. Отмытые в PBS биоптаты эндометрия дважды протирали через металлическое сито с размером ячеек 0,2 мм. Клеточную суспензию наслаивали на градиент плотности фиколла-урографина 1,06/1,078 и центрифугировали в течение 30 мин при 300 g. Культуру мононуклеарных клеток эндометрия отмывали и ресуспендировали в среде RPMI-1640 ("ПанЭко", Россия), после чего анализировали клеточный состав методом проточной цитофлуориметрии и выделяли культуру эндометриальных макрофагов для использования в эксперименте.

Свежесобранные измельченные образцы ткани миомы отмывали в среде и подвергали ферментативной обработке перед механической обработкой для получения первичных клеточных культур. Из расчета на 1 г ткани узла брали 10 мл раствора DMEM ("ПанЭко", Россия), содержащего 0,1 мг/мл коллагеназы и 0,05 мг/ мл ДНКазы IV (Sigma Aldrich, США). Образцы инкубировали в течение 20 ч при 37 °C и 5 % CO₂.

Последним этапом ферментативной обработки, необходимой для разделения клеток, особенно отделения тканевых макрофагов, была инкубация в течение 10 мин с постоянным перемешиванием и добавлением трипсина в конечной концентрации 10 мкг/мл.

Размягченные фрагменты узла протирали через металлическую сетку с размером ячеек 0,2 мм. Клетки трижды отмывали в PBS и ресуспендировали в среде DMEM, содержащей смесь антибиотиков и 10 % инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (FBS, Sigma Aldrich, США). Полученную клеточную суспензию выдерживали в течение 4 ч в холодильнике при 4 °C. Полученную первичную культуру клеток миоматозного узла анализировали методом проточной цитофлуориметрии и использовали для получения концентрированной культуры миофибробластов миоматозного узла методом магнитной сепарации с использованием CELLection™ Pan Mouse IgG (Life Technologies AS, Норвегия) и анти-CD90 (клон: eBio5E10. ThermoFisher Scientific, США).

Фенотип клеток эндометрия и миоматозного узла оценивали методом многоцветной проточной цитофлуо­риметрии с использованием моноклональных антител анти-CD68, меченных FITC (клон: eBioY1/82A. eBioscience Inc., США), анти-CD14, меченных APC (клон: 61D3. ThermoFisher Scientific, США), анти-CD16, меченных PE (клон: 3G8. Beckman Coulter, США), анти-Desmin (клон: DE-U-10. eBioscience Inc., США), анти-CD90, меченных APC (клон: eBio5E10. ThermoFisher Scientific, США).

Макрофагальный гейт строился по CD68⁺-клеткам. Мы оценивали дифференцировку макрофагов в эндометрии и миоматозных узлах по экспрессии мембранных маркеров CD14 (корецептор к липополисахаридам) и CD16 (FcγRIII). Выделяли три разных по своим функциям субпопуляции моноцитов/макрофагов: классические - CD14⁺⁺CD16^-; промежуточные - CD14⁺⁺CD16⁺ и неклассические - CD14⁺CD16⁺⁺ [13]

Из мононуклеарных клеток эндометрия получали культуру макрофагов методом двукратной адгезии на пластике в среде DMEM. Итоговая клеточная суспензия эндометриальных макрофагов для эксперимента сокультивирования состояла из более 98 % жизнеспособных клеток с фенотипом CD68⁺CD14⁺. Выделенные опухолевые миофибробласты состояли из не менее 99 % жизнеспособных Desmin⁺-клеток. Полученные популяции макрофагов и фибробластов сокультивировали в соотношении 1 : 10 течение 24 и 72 ч в 24-луночном культуральном планшете в среде DMEM, содержащей смесь антибиотиков и 10 % FBS при 37 °C и 5 % CO₂. В качестве контроля использовали фибробласты, культивировавшиеся без макрофагов. Мы не наблюдали значимых изменений количества и жизнеспособности клеток в лунках планшета на 1-е и 3-и сутки инкубации. Показатели, характеризующие выработку коллагена, оценивали в образцах, собранных по истечении 24 и 72 ч.

Отобранный супернатант маркировали и хранили при -80 °С до момента исследования. Для изучения концентрации коллагена I типа в супернатантах использовали тест-систему Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit For Collagen Type I (COL1) (Could-Clone Corp, США). Полученные результаты представлены в пг/мл.

Макрофаги удаляли из смеси клеточных культур методом позитивной магнитной сепарации. Из оставшихся фибробластов получали тотальную РНК для последующего проведения ПЦР-исследований. Уровень мРНК коллагена I типа оценивали с использованием трех наборов: "Набора для постановки обратной транскрипции", "Набора определения уровня кДНК гена Col 1A1 человека" и "Набора определения уровня кДНК гена бета-актина человека" (ООО "Фрактал Био", Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Полученные результаты представлены как коэффициент отношения количества копий мРНК коллагена I типа/мкл к количеству копий мРНК бета-актина (гена домашнего хозяйства)/мкл. Для удобства восприятия полученные значения данного коэффициента умножали на 1000.

Статистический анализ. Полученные данные по уровню мРНК коллагена I типа миофибробластами и концентрации коллагена в супернатантах представлены в виде медианы, 25-го и 75-го перцентилей [Me (Q25; Q75)]. Уровень статистической значимости различий между показателями оценивали по критерию Вилкоксона для зависимых групп. Различия между показателями рассматривались как статистически значимые при р < 0,05.

Результаты

По завершении времени сокультивирования в образцах оценивали синтез и продукцию коллагена I типа миофибробластами. Сравнение уровня мРНК коллагена I типа миофибробластами миоматозного узла на 1-е и 3-и сутки представлены в табл. 1.

Уровень мРНК коллагена I типа не имел значимых различий между контрольной культурой миофибробластов и культурой миофибробластов, культивированных с макрофагами эндометрия, в течение как 24, так и 72 ч (p = 0,108 и p = 0,31 соответственно). Во всех образцах миофибробластов миоматозных узлов, кокультивированных с аутологичными макрофагами, мРНК коллагена I типа не детектировалась. Мы зафиксировали увеличение на уровне тенденции количества мРНК коллагена I типа в миофибробластах, сокультивированных с макрофагами, на 3-и сутки в сравнении с 1-ми сутками (p = 0,067). Образование мРНК коллагена I типа восстанавливалось в образцах узловых фибробластов, в которых синтез коллагена наблюдался после суточной инкубации без макрофагов.

Дополнительно стоит отметить, что в некоторых контрольных образцах оцениваемая мРНК не детектировалась, хотя коллаген I типа выявлялся во всех контрольных образцах супернатанта (табл. 2).

Помимо подавления синтеза коллагена под влиянием макрофагов на 1-е сутки инкубации, подавлялась и его продукция. Данный эффект подтверждался снижением концентрации коллагена I типа в супернатантах после 24-часовой кокультивации фибробластов миоматозного узла с аутологичными макрофагами в сравнении с супернатантами миофибробластов контроля (p = 0,004). Концентрация коллагена I типа в супернатантах после 3-суточной инкубации повышался как при спонтанной продукции (p = 0,08), так и под влиянием эндометриальных макрофагов (p = 0,045), хотя выявленные изменения в спонтанной продукции коллагена были лишь на уровне тенденции. При этом после 3-суточной инкубации концентрация коллагена I типа была ниже при взаимодействии с аутологичными макрофагами (p = 0,010).

Для уточнения возможной роли дифференцировки макрофагов было проведено сравнение соотношения промежуточных и неклассических макрофагов (CD14⁺⁺CD16⁺/CD14⁺CD16⁺⁺), инвазирующих ткани эндометрия, расположенного в проекции узла и макрофагов тканей миомы матки (табл. 3).

При дифференцировке макрофагов эндометрия наблюдалось смещение соотношения промежуточные/неклассические макрофаги в сторону преобладания первых. В тканях самих миоматозных узлов это отношение сдвигалось в сторону неклассических или альтернативно активированных макрофагов.

Обсуждение

В миоматозных узлах обнаружена повышенная экспрессия коллагена I типа в течение всего менструального цикла по сравнению с таковым в здоровом миометрии [14]. Не для всех лейомиом накопление коллагена является основным механизмом роста узлов, менее чем в половине случаев увеличение объема узла происходит преимущественно за счет клеточной пролиферации или ввиду иных дегенеративных изменений в тканях. Это отражается в неоднородности распределения экспериментальных данных и в отсутствии детекции мРНК коллагена I типа в некоторых контрольных образцах. Отсутствие выраженного нарастания концентрации коллагена в контрольных супернатантах культур миофиброблас­тов через 3 сут инкубации позволяет предположить, что клетки, лишенные изначального микроокружения, в том числе влияния макрофагов, не способны к саморегуляции, необходимой для поддержания достаточно активной выработки коллагена. Мы можем предположить, что выявление коллагена в образцах, в которых отсутствовала детекция мРНК коллагена I типа, связано с высвобождением клетками коллагена, синтез которого происходил ранее под влиянием стимулов микроокружения, сохранявшегося на этапе получения первичной культуры клеток.

Согласно данным литературы, отложение коллагена связывают как с про-, так и с противовоспалительными макрофагами. При инфаркте миокарда профибротическими макрофагами, контролирующими функцию миофибробластов, называют M1-макрофаги [15]. В экспериментах in vitro и в моделях на мышах, напротив, было показано, что макрофаги, вырабатывающие трансформирующий фактор роста, усиливают отложение коллагена [2, 16], а подавление ИЛ-4/STAT6-сигнального пути, снижает миграцию М2-макрофагов и предотвращает фиброз в модели на мышах [17]. Провоспалительные макрофаги восстанавливают гомеостаз тканей, а матриксные металлопротеиназы, вырабатываемые макрофагами, регулируют обмен фибрина и коллагена [6, 7]. Макрофаги, поляризованные в сторону М2-фенотипа, стимулируют запуск и утяжеление фиброзирования тканей через разнообразные ауто- и паракринные механизмы, которые запускаются при межклеточных взаимодействиях и под влиянием растворимых факторов [7].

Макрофаги, инфильтрирующие эндометрий в проекции миоматозного узла, отличаются малым процентом неклассических макрофагов. При их сокультивировании с аутологичными миофибробластами миоматозного узла синтез и продукция коллагена I типа в последних подавляются.

На 3-и сутки сокультивирования клеток синтез коллагена миофибробластами восстанавливается, отмечается увеличение концентрации коллагена в супернатантах культур. Вероятно, влияние межклеточных взаимодействий и факторов, вырабатываемых миофибробластами миоматозного узла, смещает дифференцировку макрофагов в пользу неклассических или M2-макрофагов. Предполагается, что коллаген может действовать как обоюдоострый меч, выступая в качестве супрессора опухолей на ранних и промотора опухолей на поздних стадиях развития опухоли [5].

Плотность коллагена I типа является важным регулятором иммуносупрессивного фенотипа макрофагов, ассоциированных с опухолями. Этот механизм может иметь решающее значение для способности раковых заболеваний избегать иммунного разрушения и быть фактором, ограничивающим эффективность иммунотерапии [18]. Другим важным фактором влияния на дифференцировку тканевых макрофагов могут быть экзосомы, образуемые миофибробластами. В модели нефропатии на мышах, вызванной фолиевой кислотой, при введении экзосом, полученных из миофибробластов, наблюдалось тяжелое фиброзное поражение почек, а подавление продукции экзосом, напротив, предотвращало интенсивное отложение коллагена [19].

Суммируя полученные данные, можно предположить, что макрофаги с более выраженным провоспалительным потенциалом на 1-е сутки способны подавлять продукцию коллагена в ткани миоматозного узла. Однако с большой вероятностью под влиянием миофибробластов и накапливающегося коллагена на 3-и сутки дифференцировка макрофагов будет смещаться в сторону М2-макрофагов, которые способны стимулировать рост миоматозных узлов за счет накопления соединительнотканных компонентов. Регуляция активности миофибробластов через контроль дифференцировки макрофагов может служить новым подходом к терапии лейомиомы матки и иных заболеваний, связанных с фиброзом.

Заключение

Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что эндометриальные макрофаги, имеющие фенотип промежуточных макрофагов, подавляют синтез и продукцию коллагена I типа фибробластами миоматозного узла. Однако данный эффект носит лишь временный характер и утрачивается с течением времени.

Литература

1. Henderson N.C., Rieder F., Wynn T.A. Fibrosis: from mechanisms to medicines. Nature. 2020; 587 (7835): 555-66. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-020-2938-9

2. Fabre T., Barron A.M.S., Christensen S.M., Asano S., Wadsworth II M.H., Chen X., Wang J., McMahon J., Schlerman F., White A., Kravarik K., Fisher A.J., Borthwick L.A., Hart K.M., Henderson N.C., Wynn T.A., Dower K. Identification of a broadly fibrogenic macrophage subset induced by type 3 inflammation in human and murine liver and lung fibrosis. BioRxiv. 2022; 498017. DOI: https://doi.org/10.1101/2022.07.01.498017

3. Belloni A., Furlani M., Greco S., Notarstefano V., Pro C., Randazzo B., Pellegrino P., Zannotti A., Carpini G.D., Ciavattini A., Di Lillo F., Giorgini E., Giuliani A., Cinti S., Ciarmela P. Uterine leiomyoma as useful model to unveil morphometric and macromolecular collagen state and impairment in fibrotic diseases: An ex-vivo human study. Biochim. Biophys. Acta Mol. Basis Dis. 2022; 1868 (12): 166494. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2022.166494

4. Fang M., Yuan J., Peng C., Li Y. Collagen as a double-edged sword in tumor progression. Tumour Biol. 2014; 35 (4): 2871-82. DOI: https://doi.org/10.1007/s13277-013-1511-7

5. Gupta A.A., Kheur S., Palaskar S.J., Narang B.R. Deciphering the "Collagen code" in tumor progression. J. Cancer Res. Ther. 2021; 17 (1): 29-32. DOI: https://doi.org/10.4103/jcrt.JCRT_489_17

6. Vannella K.M., Wynn T.A. Mechanisms of organ injury and repair by macrophages. Annu. Rev. Physiol. 2017; 79: 593-617. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev-physiol-022516-034356

7. Максимова А.А., Шевела Е.Я., Черных Е.Р. Роль макрофагов в патогенезе легочного фиброза. Иммунология. 2024; 45 (2): 235-44. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-2-235-244

8. Максимова А.А., Сахно Л.В., Останин А.А. Фиброгенный и фибролитический потенциал различно активированных макрофагов человека. Медицинская иммунология. 2023; 25 (3): 453-8. DOI: https://doi.org/10.15789/1563-0625-FAF-2713

9. Wang Y., Geng X., Guo Z., Chu D., Liu R., Cheng B., Cui H., Li C., Li J., Li Z. M2 macrophages promote subconjunctival fibrosis through YAP/TAZ signalling. Ann. Med. 2024; 56 (1): 2313680. DOI: https://doi.org/10.1080/07853890.2024.2313680

10. Song J., Ke B., Fang X. APC and ZBTB2 may mediate M2 macrophage infiltration to promote the development of renal fibrosis: a bioinformatics analysis. Biomed. Res. Int. 2024; 2024: 5674711. DOI: https://doi.org/10.1155/2024/5674711

11. Santacroce G., Di Sabatino A. UnTWISTing intestinal fibrosis: single-cell transcriptomics deciphers fibroblast heterogeneity, uncovers molecular pathways, and identifies therapeutic targets. J. Clin. Invest. 2024; 134 (18): e184112. DOI: https://doi.org/10.1172/JCI184112

12. Ефремова Н.А., Грешнякова В.А., Горячева Л.Г. Современные представления о патогенетических механизмах фиброза печени. Журнал инфектологии. 2023; 15 (1): 16-24. DOI: https://doi.org/10.22625/2072-6732-2023-15-1-16-24

13. Ziegler-Heitbrock L., Ancuta P., Crowe S., Dalod M., Grau V., Hart D.N., Leenen P.J., Liu Y.J., MacPherson G., Randolph G.J., Scherberich J., Schmitz J., Shortman K., Sozzani S., Strobl H., Zembala M., Austyn J.M., Lutz M.B. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 2010; 116 (16): e74-80. DOI: https://doi.org/10.1182/blood-2010-02-258558

14. Iwahashi M., Muragaki Y., Ikoma M., Mabuchi Y., Kobayashi A., Tanizaki Y., Ino K. Immunohistochemical analysis of collagen expression in uterine leiomyomata during the menstrual cycle. Exp. Ther. Med. 2011; 2 (2): 287-90. DOI: https://doi.org/10.3892/etm.2011.186

15. Zhang Y.Z., Wu Y., Li M.J., Mijiti A., Cheng L.F. Identification of macrophage driver genes in fibrosis caused by different heart diseases based on omics integration. J. Transl. Med. 2024; 22 (1): 839. DOI: https://doi.org/10.1186/s12967-024-05624-7

16. Намаканова О.А., Губернаторова Е.О., Чичерина Н.Р., Зварцев Р.В., Друцкая М.С. Экспериментальная модель легочного фиброза у мышей, индуцированная посредством аэрозольной доставки LPS. Российский иммунологический журнал. 2024; 27 (2): 145-50. DOI: https://doi.org/10.46235/1028-7221-16876-EMM

17. Zhou Y., Li Z., Yu S., Wang X., Xie T., Zhang W. Iguratimod prevents renal fibrosis in unilateral ureteral obstruction model mice by suppressing M2 macrophage infiltration and macrophage-myofibroblast transition. Ren. Fail. 2024; 46 (1): 2327498. DOI: https://doi.org/10.1080/0886022X.2024.2327498

18. Larsen A.M.H., Kuczek D.E., Kalvisa A., Siersbæk M.S., Thor­seth M.L., Johansen A.Z., Carretta M., Grøntved L., Vang O., Madsen D.H. Collagen Density Modulates the Immunosuppressive Functions of Macrophages. J. Immunol. 2020; 205 (5): 1461-72. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1900789

19. Yu W., Song J., Chen S., Nie J., Zhou C., Huang J., Liang H. Myofibroblast-derived exosomes enhance macrophages to myofibroblasts transition and kidney fibrosis. Ren. Fail. 2024; 46 (1): 2334406. DOI: https://doi.org/10.1080/0886022X.2024.2334406

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)