Индукция экспрессии Т-клеточных рецепторов против эпитопов антигенов, ассоциированных с меланомой, клонирование и получение генетически модифицированных TCR-T-клеток

• Шевченко Юлия Александровна
• Лопатникова Юлия Анатольевна
• Фишер Марина Сергеевна
• Курилин Василий Васильевич
• Филиппова Юлия Григорьевна
• Алсаллум Алаа
• Алрхмун Салех
• Перик-Заводская Ольга Юрьевна
• Перик-Заводский Роман Юрьевич
• Назаров Кирилл Вячеславович
• Булыгин Алексей Сергеевич
• Голикова Елена Алексеевна
• Шаньгина Полина Андреевна
• Гизбрехт Анастасия Александровна
• Воробьева Ольга Петровна
• Силков Александр Николаевич
• Сенников Сергей Витальевич

Резюме

Введение. Способность иммунных клеток уничтожать опухолевые клетки за счет распознавания опухолевых антигенов T-клеточным рецептором (TCR) и передача активирующих сигналов внутрь клетки лежит в основе современной иммунотерапии онкологических заболеваний. Развитие технологии изоляции и клонирования рецепторов Т-клеток и генной инженерии позволило создать Т-клетки пациентов, кодирующие TCR к опухолевым антигенам, способные эффективно уничтожать опухолевые клетки.

Цель - получение генетически модифицированных TCR-T-клеток, нацеленных на распознавание эпитопов антигенов, ассоциированных с меланомой, с помощью индукции антиген-специфических Т-клеток и секвенирования РНК единичных клеток.

Материал и методы. Мононуклеарные клетки периферической крови здоровых доноров с генотипом HLA-A02 были использованы для генерации дендритных клеток, нагруженных пептидами целевых антигенов и последующей клональной экспансии антиген-специфических T-клеток. Анализ последовательности TCR проводили с помощью РНК-секвенирования единичных клеток. Биоинформатический анализ с использованием разных подходов позволил получить последовательности TCR для последующего клонирования и экспрессии в лентивирусном векторе. Полученные векторы были использованы для трансдукции Т-клеток и оценки цитотоксической активности против клеточных линий меланомы с наличием экспрессии PRAME и MART-1 [SK-Mel-5 и SK-Mel-37, предоставлены профессором Х. Шику из коллекции Высшей школы медицины Университета Миэ (Япония)]. Трансдуцированные T-клетки культивировали с опухолевыми клетками в соотношении 10 : 1, а цитотоксический эффект оценивали по уровню фермента лактатдегидрогеназы, который выделяется из лизированных клеток.

Результаты. В результате клональной экспансии было получено практически 1000-кратное обогащение исходной популяции антиген-специфических клеток. Клетки со стабильной экспансией специфических TCR и пролиферативной активностью были использованы для анализа транскриптома на платформе BD Rhapsody. Для определения оптимальной стратегии выбора антиген-специфических TCR мы использовали нейросеть ERGO-II, предсказывающую аффинитет TCR к целевому пептиду антигена PRAME, и определяли доминантность клонотипа для TCR, распознающих MART-1. Трансдукция Т-лимфоцитов лентивирусными конструкциями, кодирующими полученные TCR, привела к лизису не менее 30 % клеток-мишеней в первые же сутки взаимодействия с опухолевыми клетками.

Заключение. Мы достигли значительного обогащения популяции целевых антиген-специфических клеток в количествах, достаточных для проведения анализа транскриптома единичных клеток и клонотипов Т-клеток. С помощью технологии секвенирования РНК единичных клеток получили подробную информацию о последовательности каждого TCR и иммунном транскриптоме единичной Т-клетки, что позволило точно сконструировать полученные клоны TCR, оценить функциональное состояние клеток и улучшить отбор клонов-кандидатов TCR. Полученные последовательности для TCR были использованы для наработки лентивирусных конструкций, показавших свою эффективность при взаимодействии Т-клеток, трансдуцированных этими конструкциями, с клетками-мишенями.

Ключевые слова: T-клеточный рецептор (TCR); меланома; транскиптом; секвенирование; аффинитет; клонотип

Введение

Иммунотерапия онкологических заболеваний основана на концепции о том, что иммунные клетки способны уничтожать опухолевые клетки за счет механизмов, основанных на распознавании эпитопов опухолевых антигенов T-клеточным рецептором (TCR) и передаче активирующих сигналов внутрь клетки. Развитие технологии изоляции и клонирования рецепторов Т-клеток позволило Т-клеткам пациентов после транс­дукции генетическими конструкциями, кодирующими TCR, приобрести новые "компетенции": более эффективно распознавать эпитопы опухолевых антигенов в комплексе с антигенами гистосовместимости и передавать стимулирующие сигналы посредством фосфорилирования белкового мотива ITAM для реализации иммунных эффектов Т-клеток [1]. Адоптивный перенос антиген-специфических Т-клеток в форме инфузии приводит к появлению клеток в количестве, значительно превышающем то, которое может наблюдаться при эндогенном ответе [2]. Полученные TCR-T-клетки могут специфически распознавать ассоциированные с опухолью антигены и эффективно уничтожать опухолевые клетки [3].

Хотя TCR-T-клетки могут распознавать любые опухолевые антигены, число идентифицированных мишеней, для которых показана достаточная безопасность и эффективность, на сегодняшний день остается ограниченным. Основным соображением при выборе подходящего целевого антигена для терапии TCR-T-клетками должна быть высокая специфичность антигена. Целевые антигены, высокоэкспрессируемые в опухолях, но на низком уровне в нормальной ткани, часто выбираются для ограничения любых потенциальных нецелевых эффектов и токсичности, ограничивающей дозу, возникающей в результате разрушения нормальной ткани, экспрессирующей целевой антиген [4]. Создание достаточного количества вариантов TCR к различным антигенам позволит создать мощный терапевтический инструмент для терапии широкого спектра онкологических заболеваний. Ранее нами была показана эффективность применения генетически модифицированных T-клеток с экспрессией TCR, распознающего раково-тестикулярный антиген NY-ESO-1 [5, 6]. В своей работе мы использовали два типа антигена для создания оригинальных конструкций, кодирующих целевой TCR: опухоль-специфический антиген PRAME и дифференцировочный антиген MART-1 [7].

PRAME (Preferentially Expressed Antigen in Melanoma - предпочтительно экспрессируемый антиген в меланоме) - раково-тестикулярный антиген, который также известен как CT130 (раковый антиген яичек 130), MAPE (антиген меланомы, предпочтительно экспрессируемый в опухолях) и OIP-4 (Opa-взаимодействующий белок 4). Ген PRAME кодирует связанный с мембраной белок и вызывает аутологичные цитотоксические иммунные реакции, опосредованные Т-клетками [8-10]. Ген PRAME гиперметилирован в нормальных тканях, но гипометилирован в большинстве злокачественных клеток [11]. Высокие уровни PRAME обнаруживаются при различных злокачественных новообразованиях [12], не только в солидных опухолях, но и в лейкозных клетках [13].

Антиген дифференцировки меланомы (MDA) MART-1 экспрессируется в меланоцитах в 80-95 % меланом [14]. Таким образом, антиген PRAME экспрессируется во многих типах опухолей, включая меланому, а MART-1 преимущественно в меланоме, что дает возможность получения TCR с широким спектром действия или высокой эффективностью за счет высокой степени присутствия антигена соответственно.

Для получения популяции Т-клеток, обогащенной по экспрессии TCR, распознающих эпитопы целевых антигенов, мы использовали праймирование с помощью дендритных клеток, нагруженных антигенными пептидами. Анализ последовательности TCR проводили с помощью РНК-секвенирования единичных клеток. Биоинформатический анализ полученных данных позволил определить последовательности TCR для последующего клонирования и экспрессии в лентивирусном векторе.

Материал и методы

Участники исследования. В работе использовали периферическую кровь условно-здоровых доноров с наличием аллеля HLA-A02, определенного методом проточной цитометрии с использованием антител против HLA-A02 человека (Biolegend, США). Средний возраст доноров составил 27,33 ± 6,34 года (среднее ± SE) (3 мужчины, 4 женщины). Гаплотип HLA-A02 преобладает у европеоидного (~ 40 %) и индейского населения, но не так часто встречается в других популяциях [15]. Все доноры подписали письменное информированное согласие на участие в исследовании.

Получение дендритных клеток. Мононуклеарные клетки периферической крови (МНК ПК) выделяли из образцов цельной крови с использованием центрифугирования на градиенте плотности фиколла-урографина (ρ = 1,077 г/л, "ПанЭко", Россия). Выделенные МНК (80-100 млн) ресуспендировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10 % фетальной телячьей сыворотки (FCS) (HiMediа, Индия), 2 мм L-глютамина ("Биолот", Россия), 5 - 10^-4 М 2-меркаптоэтанола (Sigma-Aldrich, США), 25 мм HEPES ("Биолот", Россия), 80 мкг/мл гентамицина ("Биолот", Россия) и 100 мкг/мл бензилпенициллина ("Синтез", Россия) (далее - питательная среда) до концентрации 1,5-2 млн/мл. Клеточную суспензию инкубировали в культуральном флаконе (TPP, Швейцария) в течение 30 мин в CO₂-инкубаторе.

Неприлипшие клетки аккуратно сливали и далее использовали для выделения Т-клеток. Клетки с повышенной адгезией к пластику отделяли от поверхности с помощью клеточного скребка (TPP, Швейцария). Прилипшую фракцию МНК ПК (20-25 млн клеток) культивировали в культуральном флаконе (TPP, Швейцария) в присутствии рекомбинантного человеческого ГМ-КСФ (100 нг/мл, BioLegend, США) и ИЛ-4 (50 нг/мл, BioLegend, США) в течение 4 дней для генерации незрелых дендритных клеток (ДК).

На 3-й день культивирования проводили частичную смену среды с добавлением свежей порции цитокинов. На 5-й день культивирования клетки собирали с помощью клеточного скребка, подсчитывали и переносили в 12-луночные планшеты (2 млн/лунку, 1 млн/мл).

MART-1 HLA-A02-рестриктированный пептид ELAGIGILTV (ELA) и PRAME HLA-A02-рестриктированный пептид VLDGLDVLL (VLD) ("Иммунотекс", Россия) добавляли в культуру ДК в концентрации 30 мкг/мл. На 6-й день культивирования проводили индукцию созревания ДК с помощью ФНОα (25 нг/мл, BioLegend, США).

Культивирование Т-клеток. Т-клетки выделяли из фракции неадгезивных клеток с помощью набора MojoSort™ Human CD3 T Cell Isolation Kit (Biolegend, США). В культуру выделенных Т-клеток добавляли по 10 нг/мл ИЛ-7, ИЛ-15, ИЛ-2 (все производства BioLegend, США) и Т-клетки в концентрации 2 млн/мл в течение 6 дней. На 3-й день культивирования проводили полную смену среды с цитокинами и добавляли анти-CD3-антитела (0,5 мкг/мл) и анти-CD28-антитела (1 мкг/мл) (все производства BioLegend, США). Кондиционированную среду сохраняли для дальнейшего использования.

Совместное культивирование ДК и Т-клеток. Нагруженные антигеном зрелые ДК и Т-клетки собирали, а затем совместно культивировали в новом флаконе (TPP, Швейцария) в соотношении 1 : 10 (ДК : Т-клетки). Первые 3 дня совместного культивирования проводили без дополнительной стимуляции, чтобы селективно исключить клетки, не получающие стимуляцию через свой TCR от зрелых ДК. На 4-й день в совместную культуру ДК и T-клеток добавляли анти-CD3-антитела, анти-CD28-антитела, ИЛ-7, ИЛ-15 и ИЛ-2 в ранее указанных концентрациях для поддержания жизнеспособности и пролиферации полученных Т-клеток.

Определение специфического Т-клеточного рецептора на основе технологии FLEX-Т. Для выполнения анализа и сортировки антиген-специфических клеток был использован протокол получения реагентов для окрашивания по технологии Flex-T™ HLA-A*02:01 Monomer UVX, Purified Streptavidin (Biolegend, США). Данный реагент Flex-T™ состоит из мономеров MHC в комплексе с пептидом, который разлагается под действием УФ-излучения. В процессе инкубации происходит замена на целевые пептиды, что позволяет получать реагенты к любым интересующим пептидам. Полученные мономеры инкубируют с двумя разными флуорохромами, конъюгированными со стрептавидином (APC Streptavidin и PE Streptavidin, Biolegend, США).

Для окрашивания к клеткам добавляли полученные тетрамеры Flex-T и инкубировали в течение 60 мин на льду в темноте. После двукратной отмывки путем центрифугирования при 400 g в течение 10 мин в 500 мкл PBS клетки были готовы для дальнейшего использования.

Изоляция антиген-специфических Т-клеток. На 8-й день совместного культивирования ДК и Т-клеток последовательно выделяли антиген-специфические Т-клетки из совместной культуры ДК и T-клеток с помощью негативной сортировки по CD3 и сортировки с помощью тетрамеров, полученных по технологии Flex-T. Окрашенные клетки сортировали на проточном цитометре с функцией сортировки BD FACS Aria I (BD Biosciences, США) при давлении 20 psi, режиме "Purity" со скоростью 2500 событий/сек. Клетки с двойной флуоресценцией считались истинными клетками с экспрессией целевого антиген-специфического рецептора. В исходной популяции T-клеток содержалось от 2 до 5 % антиген-специфических клеток, а чистота популяции после сортировки составляла от 70 до 90 %.

Стимуляция пролиферации клеток. Выделенные антиген-специфические Т-клетки переносили в круглодонный 96-луночный культуральный планшет в концентрации 2-4 млн/мл и культивировали в течение 14 дней в присутствии стимуляторов Т-клеточной пролиферации и 30-50 % объема предварительно сохраненной кондиционированной среды после культивирования общей популяции T-клеток со стимуляторами пролиферации при постоянном наблюдении, замене ростовых факторов и пересеве в случае активной пролиферации.

Штрихкодирование образцов Sample Tag и подсчет клеток для анализа единичных клеток в BD Rhapsody. Клетки 3 доноров с наилучшими показателями жизнеспособности и пролиферативной активности инкубировали с антителами Sample Tag (BD Biosciences, США) в течение 20 мин при комнатной температуре в соответствии с руководством пользователя системы BD Rhapsody Single-Cell Analysis System (BD Biosciences, США). После трех циклов промывки клетки окрашивали кальцеином AM (GE Healthcare, США), определяли их концентрацию на проточном цитометре Attune NxT, объединяли и ресуспендировали в холодном буфере для образцов до конечной концентрации 10 клеток/мкл и объема 620 мкл для загрузки в картридж BD Rhapsody. Качество загрузки клеток в картридж оценивали с помощью анализатора InCell Analyzer 6000 с использованием кальцеина.

Подготовка библиотеки кДНК и секвенирование. Мы использовали систему BD Rhapsody Express Single-Cell Analysis System (BD Biosciences, США) для захвата единичных клеток и подготовки библиотеки кДНК в соответствии с протоколом производителя "TCR/BCR Full Length, Targeted mRNA, and Sample Tag Library Preparation". Секвенирование проводили на секвенаторе NovaSeq 6000 (Illumina, США) с использованием проточной кюветы SP (R1 = 85, R2 = 225, 600 млн кластеров).

Обработка данных секвенирования. Файлы FASTQ обрабатывали с помощью программы BD Rhapsody pipeline v1.12 (BD Biosciences, США). Программа отфильтровывала пары низкокачественных прочтений на основе таких критериев, как длина прочтения, наибольшая частота однонуклеотидных фрагментов и средний балл качества оснований. Затем были проанализированы оставшиеся высококачественные прочтения R1 для выявления последовательностей клеточных меток и уникальных молекулярных идентификаторов (UMI).

Высококачественные прочтения R2 были выровнены с последовательностями панели мРНК с помощью Bowtie2. Считывания с идентичными метками клеток, последовательностями UMI и генами складывались в отдельные молекулы.

Количество UMI корректировали с помощью алгоритмов коррекции ошибок: рекурсивной коррекции ошибок замещения (RSEC) и коррекции ошибок на основе распределения (DBEC). Количество клеток оценивали с помощью анализа второй производной, чтобы отфильтровать зашумленные метки клеток; достоверными считали только метки клеток за пределами одной наблюдаемой точки перегиба. Далее программа использовала метки Sample Tag для демультиплексирования образцов и исключения дублетов клеток, что позволило выявить достоверные единичные клетки и причислить их к биологическим образцам. Затем программа выравнивала прочтения библиотеки TCR для каждой клетки для создания контигов TCR, аннотировала эти контиги и создавала матрицы экспрессии генов (гены/клетка) и рецепторов иммунного репертуара (AIRR) для каждого биологического образца.

Выбор наиболее аффинного клонотипа TCR при помощи нейросети ERGO-II для PRAME. Мы загрузили репозиторий нейронных сетей ERGO-II и запус­тили инструмент из терминала, выбрав входной файл и базу данных (McPAS-TCR) [16], которая содержит информацию о более чем 20 тыс. последовательностей Т-клеточных рецепторов, антигенах, с которыми они связываются, типе Т-клеток (CD4⁺/CD8⁺) и типе MHC (MHC-I/MHC-II). Входной файл CSV для ERGO-II [17] содержит информацию о последовательности TCR CDR3α и CDR3β, пептидной последовательности, типе MHC (класс MHC-I/MHC-II), генах V и J и типе Т-клеток (CD4⁺/CD8⁺), а также индексы отдельных клеток для последующего объединения рамок данных. Выходной файл содержит прогнозируемое значение для оценки связывания TCR с комплексом пептид/MHC, которое варьирует от 0 до 1, где 0 - минимальное или отсутствие сродства, а 1 - максимальное сродство (аффинитет).

Выбор доминантного клонотипа MART-1 при помощи TCRscape. Мы импортировали матрицы GEX каждого биологического образца, матрицу AIRR нескольких образцов и выходной файл ERGO-II в TCRscape [18], объединили матрицы GEX, выполнили нормализацию данных "Counts Per Million", заменили нули в кадре данных на единицы, выполнили log₂-преобразование данных, выделили Т-клетки, подсчитали доминантные клонотипы полноразмерных Т-клеточных рецепторов в выделенных Т-клетках, создали объединенный массив данных, содержащий экспрессию генов ключевых Т-клеточных маркеров (гены CD4, CD8A, FOXP3), информацию о клонотипах и оценки связывания ERGO-II, провели анализ главных компонент (PCA) для объединенного массива данных, оценили размерность объединенного массива данных с помощью диаграммы Scree и провели снижение размерности с помощью унифицированной аппроксимации и проекции многообразия (UMAP) с использованием первых 5 главных компонент.

Получение лентивирусного вектора, кодирующего TCR, специфичный к антигенам PRAME и MART-1. Мы сконструировали плазмидную вставку для лентивирусной трансферной плазмиды, которая включает последовательности TCRα и TCRβ в единой рамке считывания, разделенные посредством сигнала сброса полипептида P2A, который обеспечивает разделение полипептидных цепей во время трансляции. Полученная конструкция была клонирована в вектор pLenti hPGK, при этом ген GFP был заменен на данную вставку. Синтез данной конструкции был осуществлен компанией "Люмипроб". TCR-содержащая плазмида переноса, плазмида, кодирующая VSV-G, и две упаковочные плазмиды лентивирусов третьего поколения (содержащие гены Gag-Pol и Rev соответственно) были наработаны в штамме E. coli NEB Stable (C3040I, США) и проверены с помощью рестрикционных ферментов и гель-электрофореза. Затем с помощью Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher, США) мы доставили вышеуказанные плазмиды в упаковочные клетки HEK-293T. Наработанные лентивирусы были концентрированы при помощи коммерческого набора TransLv™ Lentivirus Precipitation Solution (TransGen, Китай) и титрованы при помощи количественной (со стандартами в разведении) ПЦР на провирусную ДНК (TransLvTM Lentivirus qPCR Titration Kit, TransGen, Китай) в целевых Т-клетках.

Трансдукция Т-клеток лентивирусными векторами. Для получения T-лимфоцитов с заданной специфичностью TCR из фракции МНК периферической крови условно-здоровых HLA A02-позитивных доноров с помощью негативной магнитной селекции выделяли CD3⁺-T-клетки. Выделенные клетки (0,75 млн/мл) инкубировали в планшете с ретронектином (25 мкг/ мл, Sci Store, Россия) и анти-CD3-антителами (5 мкг/мл, Biolegend, США) в дозе с добавлением ИЛ-2 (300 ед/мл, ООО "Биотех", Россия) в течение 72 ч.

В день трансдукции в новые лунки с ретронектином вносили 500 тыс. клеток в 500 мкл бессывороточной среды и добавляли лентивирус (500 тыс/лунку) и прота­мина сульфат (5-8 мкг/мл) для усиления трансдукции (Эллара, Россия). Планшет центрифугировали 2 ч при 600 g и 32 °С. После окончания центрифугирования к клеткам добавляли 500 мкл теплой бессывороточной среды с ИЛ-2 ("Биотех", Россия), чтобы конечная концентрация цитокина в растворе составляла 300 ЕД/ мл и инкубировали в течение ночи. Утром переносили клетки в чистые лунки с добавлением эквивалентного объема полной среды с ИЛ-2.

В последующие дни проводили визуальное наблюдение за ростом клеток, формированием конгломератов, состоянием питательной среды и каждые 2 дня проводили обновление ростовых факторов.

Оценка цитотоксической активности. Мы использовали две клеточных линии, в которых по данным Protein Atlas [19] присутствует экспрессия mRNA антигенов PRAME и MART-1 - SK-Mel-5 и SK-Mel-37 (меланома), и линию с отсутствием экспрессии MART-1 и низкой экспрессией PRAME - HCT-116 (аденокарцинома толстой кишки). Линии были предоставлены профессором Х. Шику из коллекции Высшей школы медицины Университета Миэ (Япония). Все линии экспрессировали HLA-A02. Опухолевые клетки собирали в log-фазе с помощью смеси раствора трипсина (0,25 %) и раствора Версена (Биолот, Россия) в соотношении 1 : 3. В лунки 96-луночного плоскодонного планшета рассаживали опухолевые клетки, а через 2-3 ч добавляли T-клетки в соотношении опухолевые клетки : эффекторные клетки 1 : 10.

Клетки инкубировали в течение 16-18 ч в среде с 5 % содержанием FCS. Мы использовали набор для анализа нерадиоактивной цитотоксичности CytoTox 96^® (Promega), который позволяет количественно измерить уровень лактатдегидрогеназы (ЛДГ) - стабильного цитозольного фермента, который высвобождается при гибели и лизисе клеток.

В основе анализа лежит превращение лактата в пируват под действием ЛДГ с выделением NADH, который вызывает переход солей тетразолия в окрашенный формазан. Интенсивность окрашивания пропорцио­нальна количеству лизированных клеток.

Цитотоксическую активность вычисляли по формуле:

% цитотоксичности = ОП (Т-клетки + мишени) -

- ОП (Т-клетки)/ОП [максимальный опухолевый лизис

(лизис клеток-мишеней с помощью тритона X-100)] -

- ОП [спонтанный опухолевый лизис (опухолевые

клетки без воздействий)].

Статистическую обработку данных выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 10.1 (GraphPad Software, США). Полученные данные проверяли на нормальность тестами Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Достоверность различий между группами при оценке цитотоксической активности определена с помощью двухфакторного ANOVA и критерия множественных сравнений Sidak.

Результаты

Клональная экспансия PRAME- и MART-1-специфических Т-клеток. Изначальный уровень присутствия PRAME- и MART-1-специфических Т-клеток в популяции МНК не превышал 0,002-0,005 %. После проведения индукции антиген-специфических Т-клеток с помощью нагруженных антигеном ДК мы наблюдали увеличение присутствия антиген-специфических Т-клеток до 3,18 ± 1,73 % для PRAME-специфических Т-клеток и 1,1 ± 0,59 % MART-1 специфических Т-клеток. Таким образом, мы получили обогащение исходной популяции более чем в 1000 раз. Стабильная экспансия специфических Т-клеток и пролиферативная активность с формированием кластеров пролиферирующих клеток в виде шарообразных структур отмечена для трех доноров, чьи клетки были использованы для анализа транскриптома на платформе BD Rhapsody.

Получение анти-PRAME TCR при помощи ERGO-II. Выбор PRAME-доминантного клонотипа TCR провели при помощи нейросетевого инструмента предсказания аффинитета ERGO-II, который позволяет определить вероятность связывания комплексов TCR-пептид-MHC с использованием данных об аминокислотных последовательностях α- и β-цепей TCR, типа Т-клетки (CD4/CD8), антигенного пептида и типа MHC (HLA-A*0201) в виде безразмерной величины от 0 до 1 (рис. 1). Был выбран PRAME TCR с вероятностью связывания 0,891, который был использован для создания лентивирусной конструкции.

Выделение доминантного анти-MART-1-TCR-клонотипа при помощи TCRscape. Мы импортировали сгенерированные BD Rhapsody данные в TCRscape и определили клонотипы Т-клеточных рецепторов, среди которых 2 клонотип присутствовал в 2 и более клетках (рис. 2А). Для отбора доминантных клонотипов мы использовали количество клеток на клонотип как главный критерий. Мы выявили один доминантный клонотип, который экспрессировался 8 клетками (рис. 2A, В) и был представлен преимущественно уникальной популяцией дубль-позитивных Т-клеток с экспрессией FOXP3⁺ (CD4⁺CD8⁺FOXP3⁺) (рис. 2Б, В, Д, Е, Ж), несущий α/β-TCR, способный связывать эпитопы MHC класса I, что было определено по идентичным аминокислотным последовательностям участков узнавания MHC CDR1 (DFQATT) и CDR2 (SNEGSKA) β-цепи доминантного TCR и TCR CD8⁺-Т-клеток (рис. 2Г).

Дизайн лентивирусной конструкции. Затем мы сконструировали вставку для лентивирусной плазмиды переноса. Вставка включала последовательности TCRα- и TCRβ-цепей в одной рамке считывания, разделенные сигналом для сброса полипептида с полипептидом P2A. Полученная плазмида была успешно интегрирована в лентивирусный вектор. После трансфекции собранная кондиционированная среда содержала вирусные частицы, готовые для последующей трансдукции T-клеток. Хранение лентивируса при низких температурах (-80 °C) обеспечивало его стабильность и сохранение инфекционной активности. Определение функционального титра рекомбинантных лентивирусных частиц рассчитывали на основе интегрированного числа провирусных копий в геноме клеток HEK 293T, чувствительных к лентивирусной трансдукции, используя стандартную кривую, полученную на основе qPCR. Было получено около 800 млн копий вирусных частиц для дальнейшего использования. Таким образом, мы провели полный цикл изоляции и клонирования целевого Т-клеточного рецептора от обогащения популяции антиген-специфических клеток до интеграции последовательности в лентивирус.

Цитотоксическая активность. При оценке цитотоксической функции трансдуцированных клеточных культур с использованием метода измерения уровня ЛДГ в кондиционированных средах после 18 ч культивирования с опухолевыми клетками. Было показано, что в течение этого периода TCR-T-клетки, специфичные к антигенам меланомы, способны подавлять не менее 30 % опухолевых клеток и оказывают статистически значимый цитотоксический эффект на опухолевые клеточные линии с экспрессией антигенов PRAME и MART-1, по сравнению с клетками без экспрессии PRAME и MART-1 (рис. 3).

Обсуждение

Вирусные векторы представляют собой эффективное средство модификации эукариотических клеток. В настоящее время их активно используют как для научных исследований, так и для клинической генной терапии. Самоинактивирующиеся лентивирусные векторы третьего поколения использовались для введения генов в зрелые Т-клетки для выработки иммунитета к злокачественным заболеваниям посредством доставки химерных антигенных рецепторов (CARs) или клонированных Т-клеточных рецепторов. Применение лентивирусов в генетической терапии охватывает различные области, включая лечение моногенетических нарушений, таких как наследственные метаболические заболевания, первичные иммунодефициты и гемоглобинопатии, нейродегенеративные состояния, где они могут доставлять терапевтические гены в нейроны и замедлять или останавливать прогрессирование заболевания [20-23].

V(D)J-рекомбинация TCR в процессе развития в тимусе приводит к огромному разнообразию последовательностей T-клеточных рецепторов в антиген-распознающем репертуаре Т-клеток человека. Подсчитано, что в среднем у взрослого человека насчитывается приблизительно 4 - 10¹¹ циркулирующих клеток, и 10¹⁰ уникальных клонотипов Т-клеток [24]. Таким образом, для подавляющего большинства клонов Т-клеток, обладающих специфичностью к невирусным антигенам, частота клонов в периферической крови намного ниже той, которая необходима для выделения антиген-специфических TCR с учетом современных технологий. Поэтому работы по выделению TCR обычно начинаются с метода, который позволяет обогащать Т-клетки с нужной антигенной специфичностью.

Мы применили протокол клональной экспансии Т-клеток на основе ДК, нагруженных пептидами, для индукции антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов in vitro. ДК обладают уникальной способностью захватывать и представлять антигены в сочетании с молекулами MHC класса I и класса II для активации наивных Т-клеток, что в свою очередь приводит к клональной экспансии и дифференцировке наивных Т-клеток в эффекторные Т-клетки [25]. Такой многоступенчатый, максимально оптимизированный и эффективный протокол был неоднократно использован в собственных исследованиях [26-29].

В нашей работе применение такого протокола позволило получить значительное обогащение популяции целевых антиген-специфических клеток в количествах, достаточных для проведения анализа транскриптома единичных клеток и анализа клонотипов Т-клеток с помощью TCRscape, инструмента для определения клонотипов, адаптированного к данным BD Rhapsody, или же нейросети ERGO-II для предсказания аффинитета TCR к целевому пептиду, что привело к идентификации антиген-специфических TCR.

Анализ единичных клеток является высокотехнологичным методом, который позволяет получить максимально полную информацию о функциональной активности клеток и протекающих иммунологических процессах [30]. Полученные данные о последовательности каждого TCR позволили нам точно охарактеризовать полученные клоны TCR, а информация об иммунном транскриптоме каждой Т-клетки помогла оценить функциональное состояние клеток и улучшить отбор клонов-кандидатов TCR. Это дает значительное преимущество перед используемыми в настоящее время методами, такими как секвенирование тотальной РНК, которое не дает информации о клеточном происхождении секвенированных TCR, что не позволяет определить, какие α- и β-цепи произошли от одной и той же Т-клетки, или мультиплексная ПЦР и 5´-RACE-подходы, которые демонстрируют меньшую точность и чувствительность [31].

Полученные с помощью данной технологии TCR при интеграции в Т-лимфоциты уже в первые сутки совместного культивирования с опухолевыми клетками с экспрессией PRAME и MART-1 оказывают заметный цитотоксический эффект на клетки-мишени. TCR-T-клетки могут достигать цитотоксического эффекта в отношении мишеней с помощью различных механизмов, включающих повышение экспрессии генов хемокиновых рецепторов, способствующих миграции к опухолевым клеткам, генов, связанных с цитотоксичностью, генов, кодирующих рецепторы естественных клеток-киллеров (НК), генов транскрипционных факторов, генов ингибиторов контрольных точек.

Трансдуцированные TCR T-клетки обладают потенциалом опосредовать противоопухолевые эффекты как посредством антиген-независимых НК-подобных, так и антиген-специфических ответов, опосредованных цитотоксическими CD8⁺-T-лимфоцитами [32]. Кроме того, трансдуцированные TCR-T-клетки способны к повышенной продукции биологически активных молекул, опосредующих цитотоксические эффекты, таких как гранзимы и растворимый Fas-лиганд [33].

Заключение

TCR-T-клеточная терапия является многообещающим подходом в области иммунотерапии онкологических заболеваний, предоставляя возможность направленно атаковать опухолевые клетки с высокой специфичностью и эффективностью. Создание конструкций для TCR-терапии имеет важное фундаментальное и клиническое значение, так как позволяет создать TCR, максимально соответствующий наиболее распространенному варианту MHC I и преобладающему типу онкологических заболеваний в популяции.

Большинство конструкций, кодирующих TCR целевой специфичности, защищены патентами, которые ограничивают их свободное распространение, поскольку создание TCR требует серьезных материальных вложений, интеллектуального труда и обширных знаний в области молекулярной иммунологии, генной инженерии и анализе данных.

Таким образом, создание TCR имеет еще и выраженный экономический эффект. Для создания TCR-T-клеток в данной работе был выбран метод доставки генов с помощью лентивирусной трансдукции, поскольку такой подход является надежным и эффективным средством для достижения стабильной интеграции и долгосрочной экспрессии генов TCR. Этот метод обеспечивает высокий уровень эффективности трансдукции и устойчивую экспрессию генов, что критически важно для наработки большого числа лентивирусных копий. Эффективность данного подхода in vitro была показана при взаимодействии трансдуцированных клеток с опухолевыми клетками-мишенями.

Литература

1. Fesnak A.D., June C.H., Levine B.L. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 2016; 16 (9): 566-81. DOI: https://doi.org/10.1038/nrc.2016.97

2. Baulu E., Gardet C., Chuvin N., Depil S. TCR-engineered T cell therapy in solid tumors: State of the art and perspectives. Sci. Adv. 2023; 9 (7): eadf3700. DOI: https://doi.org/10.1126/sciadv.adf3700

3. Liu Y., Yan X., Zhang F., Zhang X., Tang F., Han Z., Li Y. TCR-T immunotherapy: the challenges and solutions. Front. Oncol. 2022; 11: 794183. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2021.794183

4. Zhao Q., Jiang Y., Xiang S., Kaboli P.J., Shen J., Zhao Y., Wu X., Du F., Li M., Cho C.H., Li J, Wen Q, Liu T, Yi T, Xiao Z. Engineered TCR-T Cell immunotherapy in anticancer precision medicine: pros and cons. Front Immunol. 2021; 12: 658753. DOI: https://DOI.org/10.3389/fimmu.2021.658753

5. Кузнецова М.С., Терещенко В.П., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Курилин В.В., Алсаллум А., Алрхмун С., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Фенотипические и функциональные особенности генерированных in vitro TCR-Т-клеток, специфичных к опухоль-ассоциированному антигену NY-ESO-1. Иммунология. 2022; 43 (5): 536-47. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-536-547

6. Терещенко В.П., Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Курилин В.В., Алсаллум А., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Характеристика лимфоцитов с MAGE-A4-специфичным TCR-подобным CAR-рецептором in vitro. Иммунология. 2022; 43 (4): 401-11. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-401-411

7. van der Bruggen. Cancer antigenic peptide database. URL: https://caped.icp.ucl.ac.be/about (n.d., date of access 20.05.2019)

8. Ikeda H., Lethé B., Lehmann F., van Baren N., Baurain J.F., de Smet C., Chambost H., Vitale M., Moretta A., Boon T., Coulie P.G. Characterization of an antigen that is recognized on a melanoma showing partial HLA loss by CTL expressing an NK inhibitory receptor. Immunity. 1997; 6 (2): 199-208. DOI: https://doi.org/10.1016/s1074-7613(00)80426-4

9. van Baren N., Chambost H., Ferrant A., Michaux L., Ikeda H., Millard I., Olive D., Boon T., Coulie P.G. PRAME, a gene encoding an antigen recognized on a human melanoma by cytolytic T cells, is expressed in acute leukaemia cells. Br. J. Haematol. 1998; 102 (5): 1376-9. DOI: https://doi.org/10.1046/j.1365-2141.1998.00982.x

10. Goodison S., Urquidi V. The cancer testis antigen PRAME as a biomarker for solid tumor cancer management. Biomark. Med. 2012; 6 (5): 629-32. DOI: https://doi.org/10.2217/bmm.12.65

11. Ortmann C.A., Eisele L., Nückel H., Klein-Hitpass L., Führer A., Dührsen U., Zeschnigk M. Aberrant hypomethylation of the cancer-testis antigen PRAME correlates with PRAME expression in acute myeloid leukemia. Ann. Hematol. 2008; 87 (10): 809-18. DOI: https://doi.org/10.1007/s00277-008-0514-8

12. Xu Y., Zou R., Wang J., Wang Z.W., Zhu X. The role of the cancer testis antigen PRAME in tumorigenesis and immunotherapy in human cancer. Cell Prolif. 2020; 53 (3): e12770. DOI: https://doi.org/10.1111/cpr.12770

13. Hermes N., Kewitz S., Staege M.S. Preferentially Expressed Antigen in Melanoma (PRAME) and the PRAME family of leucine-rich repeat proteins. Curr. Cancer Drug Targets. 2016; 16 (5): 400-14. DOI: https://doi.org/10.2174/1568009616666151222151818

14. Rohaan M.W., Gomez-Eerland R., van den Berg J.H., Geukes Foppen M.H., van Zon M., Raud B., Jedema I., Scheij S., de Boer R., Bakker N.A.M., van den Broek D., Pronk L.M., Grijpink-Ongering L.G., Sari A., Kessels R., van den Haak M., Mallo H.A., Karger M., van de Wiel B.A., Zuur C.L., Duinkerken C.W., Lalezari F., van Thienen J.V., Wilgenhof S., Blank C.U., Beijnen J.H., Nuijen B., Schumacher T.N., Haanen J.B.A.G. MART-1 TCR gene-modified peripheral blood T cells for the treatment of metastatic melanoma: a phase I/IIa clinical trial. Immunooncol. Technol. 2022; 15: 100089. DOI: https://doi.org/10.1016/j.iotech.2022.100089

15. Tsimberidou A.M., Van Morris K., Vo H.H., Eck S., Lin Y.F., Rivas J.M., Andersson B.S. T-cell receptor-based therapy: an innovative therapeutic approach for solid tumors. J. Hematol. Oncol. 2021; 14 (1): DOI: https://doi.org/10.1186/s13045-021-01115-0

16. Tickotsky N., Sagiv T., Prilusky J., Shifrut E., Friedman N. McPAS-TCR: a manually curated catalogue of pathology-associated T cell receptor sequences. Bioinformatics. 2017; 33 (18): 2924-9. DOI: https://DOI.org/10.1093/bioinformatics/btx286

17. TCRscape/preERGO-II. URL: https://github.com/Perik-Zavodskii/TCRscape/blob/main/pre%20ERGO-II.ipynb

18. TCRscape - a tool for simultaneous multimodal gene expression and clonotype analysis of single T-cells profiled via the BD Rhapsody system. URL: https://github.com/Perik-Zavodskii/TCRscape

19.  Human Protein Atlas. URL: www.proteinatlas.org

20. Brasseur F., Rimoldi D., Liénard D., Lethé B., Carrel S., Arienti F., Suter L., Vanwijck R., Bourlond A., Humblet Y., Vacca A., Conese M., Lahaye T., Degiovanni G., Deraemaecker R., Beauduin M., Sastre X., Salamon E., Dréno B., Jäger E., Knuth A., Chevreau C., Suciu S., Lachapelle J-M., Pouillart P., Parmiani G., Lejeune F., Cerottini J-C., Boon T., Marchand M. Expression of MAGE genes in primary and metastatic cutaneous melanoma. Int. J. Cancer. 1995; 63 (3): 375-80. DOI: https://doi.org/10.1002/ijc.2910630313

21. Brichard V.G., Lejeune D. GSK’s antigen-specific cancer immunotherapy programme: pilot results leading to Phase III clinical development. Vaccine. 2007; 25 Suppl 2: B61-71. DOI: https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2007.06.038

22. Dhodapkar M.V., Osman K., Teruya-Feldstein J., Filippa D., Hedvat C.V., Iversen K., Kolb D., Geller M.D., Hassoun H., Kewalramani T., Comenzo R.L., Coplan K., Chen Y.T., Jungbluth A.A. Expression of cancer/testis (CT) antigens MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, CT-7, and NY-ESO-1 in malignant gammopathies is heterogeneous and correlates with site, stage and risk status of disease. Cancer Immun. 2003; 3: 9. PMID: 12875607

23. Frank A.M., Braun A.H., Scheib L., Agarwal S., Schneider I.C., Fusil F., Perian S., Sahin U., Thalheimer F.B., Verhoeyen E., Buchholz C.J. Combining T-cell-specific activation and in vivo gene delivery through CD3-targeted lentiviral vectors. Blood Adv. 2020; 4 (22): 5702-15. DOI: https://doi.org/10.1182/bloodadvances.2020002229

24. Lythe G., Callard R.E., Hoare R.L., Molina-París C. How many TCR clonotypes does a body maintain? J. Theor. Biol. 2016; 389: 214-24. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jtbi.2015.10.016

25. Hato L., Vizcay A., Eguren I., Pérez-Gracia J.L., Rodríguez J., Gállego Pérez-Larraya J., Sarobe P., Inogés S., Díaz de Cerio A.L., Santisteban M. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Cancers (Basel). 2024; 16 (5): 981. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers16050981

26. Kuznetsova M., Lopatnikova J., Khantakova J., Maksyutov R., Maksyutov A., Sennikov S. Generation of populations of antigen-specific cytotoxic T cells using DCs transfected with DNA construct encoding HER2/neu tumor antigen epitopes. BMC Immunol. 2017; 18: 31. DOI: https://doi.org/10.1186/s12865-017-0219-7

27. Kuznetsova M., Lopatnikova J., Shevchenko J., Silkov A., Maksyutov A., Sennikov S. Cytotoxic activity and memory T Cell subset distribution of in vitro-stimulated CD8⁺ T Cells Specific for HER2/neu Epitopes. Front. Immunol. 2019; 10: 1017. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.01017

28. Shevchenko J.A., Khristin A.A., Kurilin V.V., Kuznetsova M.S., Blinova D.D., Starostina N.M., Sidorov S.V., Sennikov S.V. Autologous dendritic cells and activated cytotoxic T-cells as combination therapy for breast cancer. Oncol. Rep. 2019; 43: 671-80. DOI: https://doi.org/10.3892/or.2019.7435

29. Obleukhova I., Kiryishina N., Falaleeva S., Lopatnikova J., Kurilin V., Kozlov V., Vitsin A., Cherkasov A., Kulikova E., Sennikov S. Use of antigen-primed dendritic cells for inducing antitumor immune responses in vitro in patients with non-small cell lung cancer. Oncol. Lett. 2018; 15: 1297-306. DOI: https://doi.org/10.3892/OL.2017.7403

30. Перик-Заводская О.Ю., Перик-Заводский Р.Ю., Сенников С.В. Инновационные подходы в иммунологии: мультиомика единичных клеток и пространственная транскриптомика. Иммунология. 2024; 45 (4): 414-26. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-4-414-426

31. Adamopoulos P.G., Tsiakanikas P., Stolidi I., Scorilas A. A versatile 5’ RACE-Seq methodology for the accurate identification of the 5’ termini of mRNAs. BMC Genomics. 2022; 23 (1): 163. DOI: https://doi.org/10.1186/s12864-022-08386-y

32. Alsalloum A., Alrhmoun S., Perik-Zavosdkaia O., Fisher M., Volynets M., Lopatnikova J., Perik-Zavodskii R., Shevchenko J., Philippova J., Solovieva O., Zavjalov E., Kurilin V., Shiku H., Silkov A., Sennikov S. Decoding NY-ESO-1 TCR T cells: transcriptomic insights reveal dual mechanisms of tumor targeting in a melanoma murine xenograft model. Front. Immunol. 2024, 15: 1507218. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2024.1507218

33. Alsalloum A., Alrhmoun S., Shevchenko J., Fisher M., Philippova J., Perik-Zavodskii R., Perik-Zavodskaia O., Lopatnikova J., Kurilin V., Volynets M., Akahori Y., Shiku H., Silkov A., Sennikov S. TCR-engineered lymphocytes targeting NY-ESO-1: in vitro assessment of cytotoxicity against tumors. Biomedicines. 2023; 11 (10): 2805. DOI: https://doi.org/10.3390/biomedicines11102805

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)