Изучение роли ИЛ-7 в восстановлении численности Т-клеток после индукции лимфопении в отсутствие тимопоэза у мышей

Резюме

Резюме. В работе исследовано влияние ИЛ-7 на динамику восстановления пула Т-клеток после индукции лимфопении у тимэктомированных мышей. Показано, что введение рекомбинантного ИЛ-7 в отсутствие тимопоэза неспособно компенсировать недостаточность регенерации периферического отдела Т-клеточного звена иммунной системы при лимфопении, индуцированной сублетальным облучением. Повышение уровня гомеостатической пролиферации на фоне введения рекомбинантного ИЛ-7 в отсутствие поступления Т-клеток из тимуса ведет к усилению конверсии фенотипа оставшихся радиорезистентных наивных Т-лимфоцитов в фенотип центральных T-клеток, относительному накоплению последних и, возможно, гибели части активно пролиферирующих Т-клеток. Следствием развивающихся событий может стать резкое сужение репертуара Т-клеточных рецепторов, нарушение полноценного иммунного надзора и развитие онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний.

Ключевые слова:Т-лимфоциты; Т-клетки памяти; лимфатические узлы; селезенка; костный мозг; ИЛ-7; ионизирующая радиация; регенерация; проточная цитометрия

Для цитирования: Донецкова А.Д., Шарова Н.И., Никонова М.Ф., Литвина М.М., Комогорова В.В., Митин А.Н. Изучение роли ИЛ-7 в восстановлении численности Т-клеток после индукции лимфопении в отсутствие тимопоэза у мышей. Иммунология. 2019; 40 (5): 29-43. doi: 10.24411/0206-4952-2019-15004.

Финансирование. Работа проведена в рамках госзадания ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России на 2018 г. по теме: "Генетический контроль радиочувствительности и механизмы пострадиационного восстановления иммунной системы".

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Введение

Многие вопросы, связанные с восстановительными процессами в Т-клеточной популяции, были рассмотрены еще в 1970-е годы [1, 2]. Однако системное изучение гомеостатических процессов в лимфоидной ткани началось на рубеже 1980-1990-х годов. Тогда было установлено, что лимфопения различного генеза ведет к усилению гомеостатической пролиферации - пролиферации периферических лимфоцитов в отсутствие контакта с антигеном - и частичному восстановлению численности лимфоцитов. В опытах с повторными пассажами Т-клеток в лимфопеническое окружение было показано их многократное увеличение, которое в отдельных экспериментах в 1015 раз превышало изначальный уровень [3]. Позже была установлена роль интерлейкина-7 (ИЛ-7) в этом процессе. В модели лимфопении на мышах было показано, что гомеостатическая пролиферация не запускалась при переносе мышам дикого типа Т-клеток без рецептора к ИЛ-7, а также нормальных Т-клеток мышам, нокаутированным по гену IL7 [4]; в обоих случаях трансплантированные Т-клетки погибали в течение 2-4 нед. Для наивных Т-клеток была установлена роль распознавания Т-клеточным рецептором (ТКР) комплексов аутологичных МНС с пептидом [5]; включение гомеостатической пролиферации происходило при субоптимальной стимуляции Т-клеточного рецептора [6]. Таким образом, в состоянии покоя жизнеспособность наивных Т-клеток поддерживается синергией слабых сигналов от ТКР при контакте с собственными комплексами MHC-пептид и антиапоптотических сигналов, индуцированных ИЛ-7. Объем фоновой активации через ТКР не достигает уровня, необходимого для вхождения в клеточный цикл.

Костимуляция высокими дозами (или относительно высокими дозами в условиях лимфопении) ИЛ-7 или других цитокинов, рецепторы которых имеют общую γ -цепь, может индуцировать гомеостатическую пролиферацию наивных Т-лимфоцитов. Усиление гомеостатической пролиферации сопровождается конверсией фенотипа наивных Т-клеток в фенотип Т-клеткок памяти [79]. Этот феномен состоит в том, что наивные Т-клетки, вступившие в активное деление, выходят из него измененными, на их поверхности экспрессируется молекула CD44, служащая у мышей маркером Т-клеток памяти.

Поскольку при этом наивные Т-клетки не утрачивают маркера CD62L, фенотипически (CD62LhighCD44high) они оказываются идентичными центральным Т-клеткам памяти [7, 10, 11], но, в отличие от центральных Т-клеток памяти, они не проходят стадию специфической активации антигеном и формирования эффекторных Т-клеток [7]. Это превращение сопровождается функциональными изменениями, в частности у них снижен порог индукции эффекторных функций. Одновременно с конверсией фенотипа Т-клеток происходит смена хемокиновых рецепторов, что обусловливает изменение путей их рециркуляции. По своим миграционным характеристикам эти клетки также оказываются практически идентичными центральным Т-клеткам памяти [12], не выполняя при этом защитных функций в силу своей поликлональности и неспецифичности к таргетным антигенам, поэтому их иногда называют суррогатными Т-клетками памяти [13].

В настоящее время механизмы данных явлений изучает ограниченное число научных коллективов. В данной работе исследована способность ИЛ-7 влиять на регенерацию периферических Т-лимфоцитов, гомеостатическую пролиферацию и конверсию фенотипа наивных Т-клеток при индуцированной пострадиационной лимфопении у тимэктомированных животных - в условиях, исключающих влияние тимопоэза на процесс восстановления периферического звена Т-клеточной иммунной системы.

Материал и методы

В исследовании были использованы мыши линии C57BL/6, самки весом 18-20 г, полученные из питомника "Столбовая" (ФЛ "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России). Все манипуляции с экспериментальными мышами проводились в строгом соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS N123).

В возрасте 7-8 нед мыши были тимэктомированы. Ти-мэктомию проводили с помощью вакуумного отсоса под общей анестезией. Для анестезии мышам внутрибрюшинно вводили 10 мкл 10% раствора золетила и 5 мкл 2% раствора ксилы в 185 мкл стерильной дистиллированной воды. Через 1 мес после тимэктомии (восстановительный период) мышей подвергали воздействию у-излучения 137Cs на установке "Стебель" в дозе 4 Гр (сублетальная доза облучения). На следующий после облучения день мышам вводили рекомбинантный ИЛ-7 мыши (R&D Systems) внутрибрюшинно в дозе 1 мкг/мышь. Введение ИЛ-7 повторяли еженедельно. Забой мышей и исследование лимфоидных органов проводили через 5, 10, 20, 30 и 60 сут после облучения. Контролем служили тимэк-томированные облученные в те же сроки мыши без введения ИЛ-7 и интактные мыши соответствующего возраста. В каждой точке исследования было использовано по 7 мышей в опытной и контрольных группах.

Селезенку и лимфатические узлы (по 2 подмышечных, 2 плечевых и 2 паховых) извлекали, освобождали от соединительной ткани. Выделенные органы измельчали, клетки суспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР) ("ПанЭко", Россия) с 1% BSA (Sigma, США) и 0,1% NaN3 (Sigma, США), эритроциты селезенки удаляли с помощью лизирующего буфера (eBioscience, США). Клетки костного мозга (КМ) получали из 4 костей (2 бедренных и 2 большеберцовых), промывая их ФСБР под давлением с помощью шприца, далее их обрабатывали аналогично суспензии клеток, полученной из селезенки. Численность клеток в органе определяли путем подсчета в камере Горяева. Жизнеспособность клеток после выделения превышала 95% (методом эксклюзии 0,1% раствора трипанового синего).

В полученных суспензиях клеток методом проточной цитометрии определяли процент и абсолютное содержание Т-хелперов - CD3+CD4+, цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) - CD3+CD8+, регуляторных Т-клеток (Tрег) - CD3+CD4+CD25+Foxp3+, возрастной фенотип Т-хелперов и ЦТЛ (по особенностям соэкспрессии маркеров CD44 и CD62L [9, 11, 14]), уровень спонтанной пролиферации по экспрессии внутриклеточного маркера пролиферации Ki-67.

Для проточной цитометрии клетки инкубировали с моноклональными антителами к поверхностным маркерам в течение 30 мин при 4 °С. Затем клетки отмывали и пермеабилизировали в течение 40 мин буфером фирмы eBioscience (США) (Foxp3 Fixation/Permeabilization Buffer), согласно методическим указаниям фирмы, повторно отмывали и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте с моноклональными антителами против Ki-67 или Foxp3, снова отмывали и сразу анализировали на проточном цитометре. Учитывая минорность фракции Трег, для уменьшения ошибки анализировали ≥105 клеток, попадающих в гейт лимфоцитов. Лазерную цитометрию клеток осуществляли на проточном цитометре BD FACSCanto™ II (Becton Dickinson) в стандартном режиме. Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения FlowJo (Treestar).

Использовали следующие комбинации моноклональных антител фирмы eBioscience (США) (препараты для изотипических контролей той же фирмы):

1. Анти-CD3-FITC + анти-CD4-PerCP-Cy5.5 + анти-CD8-APC-eFluor780 + анти-CD44-PE-Cy7 + анти-СD62L-PE + анти-Ki-67-APC.

2. Анти-CD3-FITC + анти-CD4-PerCP-Cy5.5 + анти-CD25-APC + анти-Foxp3-PE.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием методов непараметрического анализа. Исследованные показатели представляли в виде Ме (L-H), где Ме - медиана, L - нижний квартиль, Н - верхний квартиль. Для сопоставления двух групп по количественным признакам использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Различие групп считали статистически значимым при p < 0,05. Обработку проводили в программном пакете StatSoftStatistica 12.0.

Результаты и обсуждение

Роль ИЛ-7 в восстановительном процессе периферического отдела Т-клеточного иммунитета изучали на модели сублетально облученных тимэктомированных мышей линии C57BL/6. Удаление тимуса за 1 мес до облучения позволяло исключить вклад тимуса в восстановление периферических Т-лимфоцитов. КМ в проведенном исследовании рассматривался в качестве как центрального, так и периферического лимфоидного органа, поскольку изучалось Т-клеточное звено иммунитета, по отношению к которому КМ является периферической клеточной нишей.

На первом этапе работы оценили субпопуляционный состав, возрастной фенотип и уровень спонтанной пролиферации Т-лимфоцитов в периферических лимфоидных органах и КМ через 1 мес после тимэктомии.

Во всех лимфоидных органах отмечено снижение численности Т-клеток относительно показателей интактных мышей соответствующего возраста (рис. 1, табл. 1): в селезенке - в 1,2 раза, в лимфатических узлах - в 1,5 раза, в КМ - в 2,6 раза. Развивающаяся Т-лимфопения в равной степени затрагивала все основные субпопуляции. Численность Т-хелперов в селезенке уменьшилась в 1,1 раза, в лимфатических узлах - в 1,7 раза, в КМ - в 3,1 раза. Количество ЦТЛ снизилось в селезенке в 1,2 раза, в лимфатических узлах - в 1,5 раза и в КМ - в 2,7 раза. Все отличия в лимфатических узлах и КМ были статистически значимыми < 0,05), а в селезенке - статистически недостоверными > 0,05). В КМ тимэктомия тоже приводила к значимому (в 2,1 раза) снижению числа СВ3+СВ4-СБ8--клеток, составляющих большую часть Т-лимфоцитов КМ. Численность Трег в лимфатических узлах и селезенке снизилась после тимэктомии пропорционально снижению всей Т-клеточной популяции, но эта разница не была статистически значимой.

Таким образом, тимэктомия приводила к пропорциональному снижению численности основных субпопуляций Т-лимфоцитов во всех лимфоидных органах и их перераспределению с преимущественным заселением селезенки.

Также мы оценили возрастную структуру Т-хелперов и ЦТЛ у тимэктомированных животных. С этой целью исследовали возрастной фенотип Т-клеточных субпопуляций по коэкспрессии поверхностных маркеров CD44 и CD62L: наивные Т-клетки (Tnaive) - CD62L+CD44lo; центральные Т-клетки памяти (Tcm) - CD62L+CD44hi; эффекторные Т-клетки памяти (Tem) - CD62L-CD44hi; и терминально-дифференцированные Т-клетки (Ttd) - CD62LCD44lo. Так как задача нашего исследования - изучить механизмы Т-клеточного гомеостаза в условиях лимфопении, наибольший интерес для нас представляли наивные Т-клетки и центральные Т-клетки памяти, на анализе которых мы и сосредоточили свое внимание (табл. 2 и 3).

В КМ снижение всех возрастных субпопуляций Т-клеток было пропорциональным и не изменило их соотношение. В селезенке доля наивных Т-хелперов снизилась с 42,7 до 28,6%, а наивных ЦТЛ - с 55,6 до 32,7%, но только последний показатель был статистически значимым. В лимфатических узлах снижение доли наивных Т-клеток было статистически значимым по сравнению с показателем интактных мышей как среди Т-хелперов, так и среди ЦТЛ и составило 63,4 против 75,7% для Т-хелперов и 69,1 против 77,2% для ЦТЛ. Уменьшение доли наивных Т-клеток обусловлено исключительно снижением их абсолютного количества (для Т-хелперов лимфатических узлов и ЦТЛ во всех периферических лимфоидных органах изменения были статистически значимыми) и не сопровождалось ростом числа центральных Т-клеток памяти. Даже в случае статистически значимого увеличения доли ЦТЛ с фенотипом центральных клеток памяти в лимфатических узлах не отмечено роста их абсолютного количества.

Полученные данные свидетельствовали о том, что развивавшаяся после удаления тимуса Т-лимфопения не сопровождалась конверсией фенотипа наивных Т-клеток в Т-клетки памяти, которая обычно сопровождает процесс восстановления численности Т-клеток при повышении уровня их гомеостатической пролиферации, которую мы в свою очередь оценили по уровню экспрессии внутриклеточного маркера пролиферации Ki-67. Оказалось, что доля Ki-67+-клеток среди всех возрастных субпопуляций как Т-хелперов, так и ЦТЛ не только не повышалась, но и в случае наивных Т-хелперов даже была статистически значимо снижена (табл. 4).

Таким образом, мы установили, что тимэктомия у мышей линии C57BL/6 приводила к развитию дефицита всех периферических Т-клеток в основном за счет наивных Т-лимфоцитов. При этом развивавшаяся Т-лимфопения не вела к компенсаторному усилению гомеостатической пролиферации Т-клеток и конверсии фенотипа наивных Т-клеток в центральные Т-клетки памяти в отсутствие контакта с антигеном.

На следующем этапе работы исследовали влияние ИЛ-7 на динамику восстановления пула Т-клеток после индукции лимфопении у тимэктомированных мышей γ-облучением в сублетальной дозе. ИЛ-7 вводили 1 раз в неделю внутрибрюшинно в дозе 1,0 мкг на мышь начиная с 1-х суток после облучения. Полученные данные по содержанию основных субпопуляций Т-лимфоцитов во вторичных лимфоидных органах и КМ тимэктомированных сублетально облученных мышей представлены в табл. 5, 6 и 7.

После сублетального облучения тимэктомированных мышей имевшаяся у них Т-лимфопения усугубилась - численность Т-клеточных субпопуляций снизилась к 5-м суткам в лимфатических узлах c 60 до 10% от уровня интактных мышей для Т-хелперов, с 68 до 7% для ЦТЛ и с 64 до 12% для Трег, а в селезенке - с 93 до 52%, с 84 до 37% и с 79 до 33% соответственно (рис. 2). Все изменения были статистически значимыми по сравнению с тимэктомированными необлученными мышами < 0,05). Дальнейшая динамика восстановления периферических Т-клеток носила волнообразный характер и к 60-м суткам, последнему дню наблюдения, достигала 11% для Т-хелперов, 10% для ЦТЛ и 12% для Трег от уровня интактных мышей в лимфатических узлах и соответственно 44, 62 и 42% в селезенке. На 60-е сутки все отличия также были статистически значимыми в сравнении с тимэктомированными необлученными мышами < 0,05, см. рис. 2). Таким образом, выраженная пострадиационная Т-лимфопения в большей степени затрагивала лимфатические узлы, а не селезенку, а последующее восстановление в отсутствие тимопоэза было неэффективным и в основном происходило в селезенке.

Динамика изменений численности Т-клеток в КМ носила отличный от вторичных лимфоидных органов характер, увеличиваясь с 32 до 66% для Т-хелперов и с 38 до 70% для ЦТЛ от уровня интактных мышей к 5-м суткам после облучения, а затем опускаясь до 5% на 20-е сутки для обеих субпопуляций = 0,01 для субпопуляции Т-хелперов, р = 0,03 для субпопуляции ЦТЛ), к 60-м суткам восстанавливалась до уровня тимэктомированных необлученных мышей (р > 0,05 для обеих субпопуляций) (рис. 3).

Еженедельное введение ИЛ-7 тимэктомированным сублетально облученным мышам существенно не изменило динамику восстановления Т-клеток в лимфатических узлах (см. рис. 2 и табл. 5). Несмотря на значимые отличия на 10-е сутки для Т-хелперов и ЦТЛ (одинаковое увеличение в 1,7 раза) и на 30-е сутки только для ЦТЛ (увеличение в 1,4 раза), к 60-м суткам после облучения численность Т-клеточных субпопуляций в обеих группах не имела статистически значимых отличий. В селезенке введение ИЛ-7, статистически значимо не влияя на динамику восстановления обеих субпопуляций Т-клеток, приводило к еще более выраженному их дефициту на 60-е сутки после облучения (см. табл. 6).

Количество Т-хелперов было в 2,2 раза, а ЦТЛ в 1,3 раза ниже, чем в группе тимэктомированных облученных мышей (см. рис. 2). Восстановление Трег во вторичных лимфоидных органах при назначении ИЛ-7 изменилось незначительно, и в конце периода восстановления количество Трег статистически значимо не отличалось от уровня группы тимэктомированных облученных мышей (см. табл. 5 и 6).

В КМ на фоне введения ИЛ-7 облученным тимэктомированным мышам численность основных Т-клеточных субпопуляций (см. рис. 3 и табл. 7), статистически значимо отличаясь в некоторых точках (20-е и 30-е сутки для Т-хелперов и 10-е сутки для ЦТЛ), в конце периода восстановления в 1,5-2 раза превосходила уровень контрольных тимэктомированных облученных мышей, но эта разница не была статистически значимой. Такие результаты обусловлены большими разбросами показателей из-за малой представленности Т-клеток в КМ, и, скорее всего, их анализ не является репрезентативным при данном дизайне эксперимента.

В целом, оценивая влияние ИЛ-7 на количественное восстановление периферических Т-клеток после индукции лимфопении сублетальным облучением в отсутствие тимопоэза, можно говорить, как минимум, о неэффективности и даже отрицательном влиянии избытка данного цитокина на пострадиационную регенерацию Т-клеточного звена иммунной системы.

Отсутствие поступления новых Т-клеток из тимуса предполагало изменение соотношения основных возрастных субпопуляций Т-клеток при пострадиационном восстановлении, а именно наивных Т-клеток и центральных Т-клеток памяти. Данные по содержанию основных возрастных субпопуляций Т-лимфоцитов во вторичных лимфоидных органах и КМ представлены в табл. 8-10.

У тимэктомированных мышей на 5-е сутки после сублетального облучения численность наивных Т-клеток по отношению к показателям интактных мышей упала в лимфатических узлах с 48 до 4% для Т-хелперов (рис. 4 А) и с 62 до 2% для ЦТЛ (рис. 5 А), в селезенке - с 58 до 21% (рис. 4Б) и с 47 до 12% (рис. 5Б), соответственно. Все изменения были статистически значимыми < 0,05). Также во вторичных лимфоидных органах снизилась численность Т-клеток памяти, в наибольшей степени затронув клетки с фенотипом центральных Т-клеток памяти, которые наравне с наивными Т-клетками представляют долгоживущие и отражающие Т-клеточный гомеостаз субпопуляции. Так, их количество в лимфатических узлах снизилось с 64 до 13% для Т-хелперов (см. рис. 4А) и с 85 до 10% для ЦТЛ (см. рис. 5 А) по отношению к показателям интактных мышей, а в селезенке - с 67 до 39% (см. рис. 4Б) и с 86 до 69% (см. рис. 5Б), соответственно (для всех показателей р < 0,05). В целом, численность центральных Т-клеток памяти пострадала меньше, чем наивных Т-клеток. На протяжении всего периода восстановления количество наивных Т-клеток во вторичных лимфоидных органах оставалось примерно на одном уровне (см. рис. 4 и 5), статистически значимо более низком в сравнении с соответствующим показателем у тимэктомированных необлученных мышей < 0,05). В то же время динамика численности лимфоцитов с фенотипом центральных Т-клеток памяти в лимфатических узлах имела в разной степени выраженный пик на 20-е или на 30-е сутки, приближающийся по значению к показателям тимэктомированных необлученных мышей: для Т-хелперов - на 20-е сутки (р = 0,25 относительно тимэктомированных необлученных мышей); для ЦТЛ - на 20-е сутки (р = 0,06) и 30-е сутки (р = 0,08). К 60-м суткам после облучения численность лимфоцитов с фенотипом центральных Т-клеток памяти возвращалась к минимальным значениям, статистически значимо отличающимся от уровня тимэктомированных необлученных мышей < 0,05 как для Т-хелперов, так и для ЦТЛ). Среди ЦТЛ селезенки на 30-е сутки после облучения был отмечен рост численности клеток с фенотипом центральных Т-клеток памяти, который статистически значимо превышал уровень тимэктомированных необлученных мышей < 0,05) и сохранялся до конца периода восстановления на 60-е сутки (см. рис. 5).

Более эффективно пострадиационное восстановление наивных и центральных Т-клеток памяти происходило в КМ тимэктомированных мышей (рис. 6). До облучения численность наивных Т-хелперов и ЦТЛ составляла соответственно 25 и 28% от уровня интактных мышей, после облучения снижалась, достигая на 10-20-е сутки минимума в 2% (р < 0,05). К 60-м суткам численность наивных Т-хелперов поднималась до 15% (р > 0,05), наивных ЦТЛ - до 10% (р < 0,05). Центральные Т-хелперы памяти с 26% от уровня интактного контроля через минимум в 3% < 0,05) восстанавливались до 16% (р > 0,05), а ЦТЛ с фенотипом центральных клеток памяти, составляя 52% от уровня интактного контроля до облучения, снижались до 6% < 0,05), а к 60-м суткам достигали 90% от уровня интактного контроля < 0,05), т. е. к 60-м суткам численность ЦТЛ с фенотипом центральных Т-клеток памяти уже статистически значимо превышала соответствующий показатель у необлученных тимэктомированных мышей и практически достигала уровня, наблюдаемого у интактных мышей.

В целом, к концу периода наблюдения - на 60-е сутки после сублетального облучения - численность возрастных Т-клеточных субпопуляций характеризовалась значимым по сравнению с контрольными группами снижением числа как наивных Т-лимфоцитов, так и Т-лимфоцитов с фенотипом центральных Т-клеток памяти, но с изменением соотношения в пользу последних, что наглядно представлено на графике (рис. 7).

Еженедельное введение ИЛ-7 облученным тимэктомированным мышам мало повлияло на динамику восстановления наивных Т-клеток и центральных Т-клеток памяти (табл. 8 и 9). Так, в лимфатических узлах (см. рис. 4 и 5) введение ИЛ-7 привело к увеличению численности всех возрастных субпопуляций Т-клеток на 10-е сутки восстановления, при этом возрастание было статистически значимо только для субпопуляции наивных ЦТЛ < 0,05), и на 30-е сутки - только для Т-хелперов с фенотипом центральных Т-клеток памяти < 0,05). В селезенке (см. рис. 4 и 5) после введения ИЛ-7 пострадиационное восстановление численности исследованных возрастных субпопуляций Т-клеток протекало еще менее эффективно, при этом на 10-е сутки одновременное снижение количества наивных Т-хелперов и Т-хелперов с фенотипом центральных Т-клеток памяти относительно показателей мышей, не получавших ИЛ-7, было статистически значимым < 0,05). В КМ еженедельное введение ИЛ-7 приводило к накоплению лимфоцитов с фенотипом центральных Т-клеток памяти в конце периода восстановления после сублетального облучения (см. рис. 6), при этом для ЦТЛ это отличие было статистически значимым < 0,05).

Наиболее интересный результат был получен при анализе соотношения наивных и центральных Т-клеток памяти в конце срока восстановления - на 60-е сутки после сублетального облучения (см. рис. 7). В группе тимэктомированных сублетально облученных мышей на фоне введения рекомбинантного ИЛ-7 наблюдалось снижение соотношения Tnaive/Tcm относительно группы мышей, не получавших ИЛ-7, во всех лимфоидных органах как для Т-хелперов, так и для ЦТЛ. Статистически значимым это снижение было для Т-хелперов лимфатических узлов и КМ, а также для ЦТЛ лимфатических узлов (для всех показателей р < 0,05). В целом полученные данные свидетельствовали о том, что дополнительное введение ИЛ-7 на фоне лимфопении в отсутствие тимопоэза вело к относительному накоплению лимфоцитов с фенотипом центральных Т-клеток памяти, причиной чего могла быть избыточная гомеостатическая пролиферация, которую мы также исследовали.

После сублетального облучения тимэктомированных мышей уровень гомеостатической пролиферации Т-клеточных субпопуляций значительно возрастал как в лимфатических узлах, так и в селезенке, возвращаясь к нормальным значениям на 60-е сутки восстановительного периода (рис. 8-11).

Доля пролиферирующих (Ki-67+) Т-клеток в лимфатических узлах достигала пика дважды - на 5-е и 2030-е сутки после облучения (см. рис. 8), значимо превышая уровень необлученных мышей < 0,05). Причем только второй пик и только на 20-е сутки сопровождался ростом (восстановлением до уровня необлученных животных) абсолютного количества пролиферирующих CD4+- и CD8+-Т-клеток (см. рис. 9). Таким образом, пик на 20-е сутки мы рассматривали в качестве истинного пика усиления гомеостатической пролиферации в лимфатических узлах тимэктомированных мышей после сублетального облучения. Данный пик четко прослеживался для наивных Т-клеток, тогда как у лимфоцитов с фенотипом центральных Т-клеток памяти он смещался к 30-м суткам в случае Т-хелперов или растягивался на период с 20-х по 30-е сутки в случае ЦТЛ.

В селезенке аналогичный пик усиления гомеостатической пролиферации для Т-хелперов приходился на 30-е сутки, а для ЦТЛ - на 10-е сутки после сублетального облучения (рис. 10), так же значимо превышая уровень необлученных мышей < 0,05). В обоих случаях он не сопровождался ростом абсолютного числа пролиферирующих наивных Т-клеток, а число пролиферирующих лимфоцитов с фенотипом центральных Т-клеток памяти достигало максимума на 30-е сутки даже в случае ЦТЛ (рис. 11). Таким образом, рассматривая только наивные и центральные Т-клетки памяти в качестве отвечающих на гомеостатические сигналы изменением уровня пролиферации, мы расценили увеличение численности пролиферирующих Т-клеток на 30-е сутки после сублетального облучения в качестве истинного пика гомеостатической пролиферации в селезенке тимэктомированных мышей.

Исходя из вышеизложенного мы заключили, что уровень гомеостатической пролиферации у сублетально облученных тимэктомированных мышей увеличивался последовательно: сначала в лимфатических узлах (20-е сутки), затем в селезенке (30-е сутки) и сначала в наивных Т-клетках (20-е сутки), а затем в центральных Т-клетках памяти (30-е сутки). Таким образом, наивные Т-клетки, преимущественно локализующиеся в лимфатических узлах, в условиях пострадиационной лимфопении активно пролиферировали, но их количество не достигало начального уровня (до облучения) (рис. 4 и 5). При этом изменялась экспрессия поверхностных маркеров (CD62L, CD44) и пополнялся пул лимфоцитов с фенотипом центральных Т-клеток памяти, которые в свою очередь также активно пролиферировали и в результате восстанавливали численность более эффективно, чем наивные Т-клетки (рис. 4 и 5).

Введение ИЛ-7 в период восстановления тимэкто-мированных мышей после сублетального облучения приводило к еще более выраженному усилению гомеостатической пролиферации (рис. 8-11) и синхронизации пика, оцениваемого по абсолютному количеству пролиферирующих Т-лимфоцитов, на 30-е сутки (рис. 9 и 11). Отличия по численности Ki-67+ Т-клеток на 30-е сутки в данной группе мышей при сравнении с мышами, не получавшими ИЛ-7, были статистически значимыми для суммарных популяций Т-хелперов и ЦТЛ, во всех вторичных лимфоидных органах < 0,05), а также всех возрастных субпопуляций ЦТЛ за исключением наивных ЦТЛ в селезенке (рис. 9 и 11). К 60-м суткам численность пролиферирующих Т-лимфоцитов снижалась до уровня мышей, не получавших ИЛ-7, а в случае ЦТЛ селезенки - даже ниже этого уровня. Соответственно усиление гомеостатической пролиферации в ходе пострадиационной регенерации Т-клеточного звена периферической иммунной системы в отсутствие тимопоэза на фоне введения ИЛ-7, наблюдаемое на пике этого усиления, по всей видимости, и стало основной причиной дополнительного накопления Т-лимфоцитов с фенотипом центральных Т-клеток памяти, или, другими словами, усиления конверсии фенотипа наивных Т-клеток в Т-клетки памяти, по сравнению с мышами, не получавшими ИЛ-7.

Подводя итог, можно констатировать, что введение ИЛ-7 в отсутствие тимопоэза не способно компенсировать недостаточную регенерацию периферического отдела Т-клеточного звена иммунной системы при лимфопении, индуцированной сублетальным облучением. Повышение уровня гомеостатической пролиферации на фоне введения рекомбинантного ИЛ-7 в отсутствие поступления наивных Т-клеток ведет к усилению конверсии фенотипа оставшихся радиорезистентных наивных Т-лимфоцитов в центральные Т-клетки памяти и относительному накоплению последних, возможно, к гибели части активно пролиферирующих Т-клеток и, как следствие, к более выраженному дефициту основных Т-клеточных популяций в селезенке на 60-е сутки после облучения. Следствием развивающейся картины должно стать значительное сужение репертуара Т-клеточных рецепторов, снижение возможности осуществлять полноценный иммунный надзор и повышение риска развития онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний.

Литература

1. Ярилин А.А., Полушкина Э.Ф. Радиационное повреждение и восстановление Т-лимфоцитов. II. Динамика восстановления субпопуляций Т-клеток. Радиобиология. 1981; 21 (2): 193-7.

2. Andreson R.E., Warner N.L. Ionizing radiation and theimmune response. Adv. Immunol. 1976; 24: 215-335.

3. Rocha B., Dautigny N., Pereira P. Peripheral T lymphocytes: expansion potential and homeostatic regulation of pool sizes and CD4/CD8 ratios in vivo. Eur. J. Immunol. 1989; 19: 905-11.

4. Schluns K.S., Kieper W.C., Jameson S.C., Lefrancois L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat. Immunol. 2000; 1: 426-32.

5. Beutner U., MacDonald H.R. TCR-MHC class II interaction is required for peripheral expansion of CD4 cells in a T cell-deficient host. Int. Immunol. 1998; 10: 305-10.

6. Van Oers N.S., Killeen N., Weiss A. ZAP-70 is constitutively associated with tyrosine-phosphorylated TCR zeta in murine thymocytes and lymph node T cells. Immunity. 1994; 1: 675-85.

7. Cho B.K., Rao V.P., Ge Q. et al. Homeostasis-stimulated proliferation drives naive T cells to differentiate directly into memory T cells. J. Exp. Med. 2000; 192: 549-56.

8. Kieper W.C., Jameson S.C. Homeostatic expansion and phenotypic conversion of naive T cells in response to self peptide/MHC ligands. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1999; 96: 13 306-11.

9. Sprent J., Surh C.D. Normal T cell homeostasis: the conversion of naive cells into memory-phenotype cells. Nat. Immunol. 2011; 12: 478-84.

10. Goldrath A.W., Bogatzki L.Y., Bevan M.J. Naive T cells transiently acquire a memory-like phenotype during homeostasis driven proliferation. J. Exp. Med. 2000; 192: 557-64.

11. Sallusto F., Geginat J., Lanzavecchia A. Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance. Annu. Rev. Immunol. 2004; 22: 745-63.

12. Haluszczak C., Akue F.D., Hamilton S.E. et al. The antigen-specific CD8 + T cell repertoire in unimmunized mice includes memory phenotype cells bearing markers of homeostatic expansion. J. Exp. Med. 2009; 206: 435-48.

13. Ярилин А.А. Гомеостатические процессы в иммунной системе. Контроль численности лимфоцитов. Иммунология. 2004; 25 (5): 312-20.

14. Bansal S.S., Ismahil M.A., Goel M., Patel B. et al. Activated T lymphocytes are essential drivers of pathological remodeling in ischemic heart failure. Circ. Heart Fail. 2017; 10 (3): e003688.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»