Фенотипические и функциональные характеристики GD2-специфичных CAR-T-клеток мышей in vitro и in vivo

• Филиппова Юлия Григорьевна
• Шевченко Юлия Александровна
• Назаров Кирилл Вячеславович
• Курилин Василий Васильевич
• Фишер Марина Сергеевна
• Шику Хироши
• Сенников Сергей Витальевич

Резюме

Введение. Адоптивный перенос аутологичных модифицированных ex vivo химерным антигенным рецептором (CAR) Т-клеток представляет собой перспективный подход к терапии гематологических злокачественных новообразований, однако лечение солидных опухолей остается затруднительным. Дисиалоганглиозид (GD2) является потенциальной мишенью для CAR-T-клеточной терапии солидных опухолей, поскольку наблюдается высокая степень гомологии между антигенами человека и мыши. Сингенная модель на мышах с гомологичным антигеном как дополнительный метод доклинических исследований открывает широкие перспективы для оптимизации технологии CAR-T, что, в свою очередь, может способствовать успешному проведению клинических исследований в области терапии солидных новообразований.

Цель исследования - оценка фенотипических и цитотоксических свойств GD2-специфичных CAR-T-клеток мыши in vitro и их антиген-специфической противоопухолевой активности in vivo в сингенной модели меланомы B78-21.

Материал и методы. В работе были использованы мыши линии C57Bl/6. CD3⁺-лимфоциты мыши, выделенные с помощью магнитной сепарации, были трансдуцированы ретровирусным вектором, кодирующим GITR-лиганд (GITRL) и специфичный CAR-рецептор к молекуле GD2. Фенотип GD2-специфичных CAR-T-клеток по маркерам Т-клеток памяти (CD44 и CD62L) и истощения (PD-1 и TIM-3) был проанализирован методом проточной цитометрии. In vitro цитотоксические характеристики трансдуцированных клеток после сокультивирования с клетками-мишенями (GD2⁺-клетки B78-21 и GD2^--клетки B78-P4) были оценены по содержанию лактатдегидрогеназы в кондицио­нированных средах и методом проточной цитометрии на наличие экспрессии маркеров активации (CD69, CD137, CD154) и цитотоксичности (CD107a, CD178). Противоопухолевая активность in vivo была исследована с использованием GD2-позитивной сингенной модели меланомы B78-21 и однократного введения GD2-специфичных CAR-T-клеток в дозе 5 - 10⁶ клеток на мышь.

Результаты. В результате ретровирусной трансдукции была получена популяция CAR-T-клеток мыши, в которых доля CD8⁺-клеток в 2 раза превышает долю CD4⁺-клеток. В этой популяции преобладают CD44⁺CD62L^--клетки эффекторной памяти, однако после трансдукции наблюдается увеличение доли CD44⁺CD62L⁺-клеток центральной памяти, а также клеток, экспрессирующих маркер истощения TIM-3. После контакта с GD2⁺-клетками-мишенями достоверно увеличивается доля трансдуцированных клеток, экспрессирующих маркеры активации CD69, CD137, CD154 и маркер цитотоксичности CD107a, и наблюдается тенденция к повышению экспрессии CD178. Оценка цитотоксичности in vitro демонстрирует не только цитотоксический потенциал трансдуцированных Т-клеток, но и наличие антигенной специфичности в отношении опухолевых GD2⁺-клеток. Противоопухолевая активность CAR-T-клеток мыши in vivo проявилась в способности сдерживать рост опухолевого узла, а выживаемость мышей-опухоленосителей составила 85 дней. Медиана общей выживаемости мышей после инфузии трансдуцированных клеток составила 61,5 дня, что вдвое превышает показатели контрольных групп.

Заключение. Полученные CAR-T-клетки мыши имеют фенотип цитотоксических Т-лимфоцитов и проявляют антиген-специфические свойства как в отношении линий опухолевых GD2⁺-клеток in vitro, так и в сингенной модели меланомы B78-21 in vivo.

Ключевые слова: GD2; CAR-T-клетки мыши; ретровирусная трансдукция; цитотоксичность; сингенная модель меланомы B78-21

Введение

Клеточная иммунотерапия представляет собой основу для стремительно развивающихся технологий противоопухолевой терапии, которые активно применяются в медицинской практике на протяжении последних лет. В частности, на сегодняшний день адоптивный перенос аутологичных модифицированных ex vivo химерным антигенным рецептором (CAR) Т-клеток представляет собой перспективный подход к терапии гематологических злокачественных новообразований [1]. Основной характеристикой CAR-рецептора является его способность к распознаванию поверхностных антигенов без участия комплекса MHC и без дополнительной стимуляции, поскольку активация эффекторных клеток происходит на этапе распознавания химерным рецептором поверхностного антигена на клетках-мишенях [2]. Однако, несмотря на то что CAR-T-клетки претерпели многократные усовершенствования и сменили несколько поколений химерного рецептора, а также на то, что они успешно применяются при лечении гематологических заболеваний, до сих пор не удалось добиться желаемого успеха в терапии солидных новообразований [3].

Одной из ключевых проблем CAR-терапии солидных опухолей является отсутствие специфического антигена, экспрессия которого была бы ограничена исключительно злокачественным новообразованием [4]. Дисиалоганглиозид (GD2) экспрессируется преимущественно на клеточной поверхности различных видов опухолей у взрослых и детей, таких как меланома, нейробластома и др. [5]. В контексте CAR-T-клеточной терапии поверхностная экспрессия GD2 обеспечивает беспрепятственное распознавание мишени химерным рецептором на поверхности опухолевых клеток, при этом генетическая стабильность антигена не создает ограничений для проведения таргетной терапии [5, 6], что делает данную молекулу подходящей мишенью. Помимо этого существует ряд других проблем, ограничивающих качество проводимой CAR-T-клеточной терапии, включая физиологические барьеры и иммуносупрессивное опухолевое микроокружение [5], поэтому лечение солидных опухолей остается актуальным вопросом.

Прежде чем внедрить в клиническую практику CAR-T-клетки, необходимо провести исследования на животных, чтобы оценить безопасность и эффективность. Одним из основных методов оценки противо­опухолевой активности CAR-T-клеток является доклиническое исследование на моделях ксенотрансплантатов у мышей [7]. Однако этот подход не позволяет изучить токсические побочные эффекты в отношении нормальных тканей, а также влияние иммунокомпетентных клеток хозяина на контроль опухолевого роста и избегание опухолью иммунного надзора [8]. Кроме того, довольно трудно подобрать подходящий антиген для сингенной модели, поскольку для более точного определения профиля безопасности необходим гомолог у человека [8]. С этой точки зрения, GD2 представляется перспективной мишенью для исследования, поскольку наблюдается высокая степень гомологии между антигенами человека и мыши [9]. В связи с этим применение сингенной модели на мышах с гомологичным антигеном открывает широкие перспективы для более глубокого анализа и количественной оценки стратегий оптимизации технологии CAR-T, что, в свою очередь, может способствовать успешному проведению клинических исследований в области терапии солидных новообразований.

Разработка CAR-T-клеток мыши сопряжена с рядом проблем, которые возникают при попытке получить клетки с высокой эффективностью трансдукции, пролиферативной активностью и относительно высокой выживаемостью [8]. В отличие от ранее продемонстрированной нами эффективности GD2-специфичных CAR-T-клеток человека в условиях in vitro [10], в настоящей работе целью стало изучение свойств GD2-специфичных CAR-T-клеток мыши. Для этого была проведена оценка фенотипических и цитотоксических свойств in vitro, а также исследована противоопухолевая активность в оптимизированной GD2-позитивной сингенной модели меланомы B78- 21. Ретровирусный вектор, применявшийся для трансдукции лимфоцитов мыши, кодирует GITR-лиганд (GITRL) и GD2-специфичный CAR-рецептор, состоящий из костимулирующего домена CD28 и ξ-цепи. Данный вектор был разработан с использованием компонентов, аналогичных применяемым в клинических исследованиях CAR-T-терапии [10]. Несмотря на то что отдельные компоненты системы были исследованы ранее, комбинация GD2-специфичных CAR-T-клеток мыши, экспрессирующих GITRL, и сингенной модели меланомы B78-21 представляет собой интересную платформу для изучения противоопухолевых свойств трансдуцированных клеток. Кроме того, в конструкции CAR-рецептора использовался оптимизированный и стабилизированный одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), полученный из моноклонального антитела 220-51 мыши.

Материал и методы

Ретровирусный вектор, кодирующий GD2-специфичный химерный Т-клеточный рецептор мыши. Ретровирусный вектор, кодирующий GD2-специфичный химерный Т-клеточный рецептор мыши, был разработан и предоставлен Высшей школой медицины Университета Мие (Япония) под руководством профессора Х. Шику.

Лабораторные животные. В работе были использованы мыши линии C57Bl/6 в возрасте 8-10 нед. Животных содержали на базе вивария НИИФКИ Минобрнауки России в условиях естественного освещения и неограниченного доступа к еде и воде. Все манипуляции с лабораторными животными были предварительно одобрены локальным этическим комитетом НИИФКИ Минобрнауки России (протокол № 139 от 30.05.2022). Эксперименты были выполнены на базе НИИФКИ Минобрнауки России с соблюдением принципов гуманности в соответствии с директивой Европейского сообщества (86/609/ЕЕС). Мышей выводили из эксперимента дислокацией шейного отдела позвоночника под легким эфирным наркозом.

Выделение органов и спленоцитов. Стерильными инструментами вскрывали брюшную полость мышей и извлекали селезенку, которую переносили в чашку Петри с жидкой питательной средой RPMI-1640 ("Биолот", Россия). Спленоциты получали с помощью промывки шприцом стромы селезенки. Полученную клеточную массу в среде RPMI-1640 собирали в пробирки и центрифугировали при 1500 об/мин 10 мин. Для удаления эритроцитарной массы и стромы селезенки суспензию спленоцитов, предварительно разведенную средой RPMI-1640, центрифугировали при 1500 об/мин 10 мин в градиенте плотности фиколла-урографина ("ПанЭко", Россия). Затем собирали образовавшееся интерфазное кольцо мононуклеарных клеток (МНК) и двумя последовательными отмывками в фосфатно-солевом буфере (PBS) ("Биолот", Россия) и центрифугированием при 1500 об/мин 10 мин клетки очищали от фиколла-урографина.

Получение CD3-лимфоцитов мыши с использованием магнитной сепарации. Для получения CD3-лимфоцитов из общей клеточной суспензии применялся метод изолированной магнитной сепарации с использованием коктейля моноклональных антител, конъюгированных с биотином, и магнитных наночастиц, конъюгированных со стрептавидином (BioLegend, США). К полученному осадку МНК добавляли 1 мл раствора магнитного буфера на основе PBS, содержащим 2 мМ ЭДТА и 0,5 % бычий сывороточный альбумин (BSA) (Roche, Германия), и центрифугировали при 1500 об/ мин 10 мин. Магнитную сепарацию клеток проводили на холоде с использованием магнитного буфера и магнита MojoSort™ (BioLegend, США) согласно инструкции производителя.

Активация CD3-лимфоцитов мыши. За день до выделения CD3-лимфоцитов мыши подготавливали 6-луночный планшет с добавлением антител против CD3ε (2 мкг) и против CD28 (5 мкг) мыши (Cloud Clone Corp., Китай) в 2 мл раствора PBS на лунку и инкубировали в течение ночи при 4 °С для адсорбции антител к культуральному пластику. На следующий день лунку промывали 1 мл раствора PBS, высевали 15 - 10⁶ CD3-лимфоцитов, полученные после магнитной сепарации, в 5 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки (FCS) (HyClone, США), 2 мМ L-глутамина (Биолот, Россия), 5 - 10^-5 мМ меркапто­этанола (Sigma, США), 25 мМ HEPES (Биолот, Россия), 80 мкг/мл гентамицина (KRKA, Словения), 100 мкг/ мл ампициллина (Синтез, Россия) (далее полная среда RPMI- 1640) и 60 ЕД/мл hIL-2 (Ронколейкин, Россия) и инкубировали в течение 2 сут при 37 °С и 5 % CO₂.

Трансдукция Т-лимфоцитов мыши с использованием ретровирусного вектора. Планшеты для ретровирусной трансдукции готовили на 4-е сутки. Растворы ретровирусов размораживали на водяной бане и разводили в 4 раза раствором PBS, содержащим 2 % сывороточного альбумина человека ("Микроген", Россия) и 5 % цитратного буфера с добавлением глюкозы (ACD- A). В лунку 24-луночного планшета, предварительно покрытого 500 мкл раствора PBS с добавлением 20 мкг/ мл ретронектина (Takara Bio, Япония), добавляли 1 мл полученного раствора ретровирусов и центрифугировали с ускорением 2000 g в течение 2 ч при 32 °С. Затем лунки дважды промывали раствором PBS, содержащим 2 % сывороточного альбумина человека, и высевали 1,5 - 10⁶ Т-клеток, стимулированных антителами против CD3ε и против CD28 мыши, с добавлением 60 ЕД/мл hIL-2 ("Ронколейкин", Россия) в 1,5 мл полной среды RPMI-1640. Планшеты с клетками центрифугировали с ускорением 1000 g в течение 10 мин при 32 °С. Клетки инкубировали в течение 4 сут при 37 °С и 5 % CO₂. Жизнеспособность клеточных культур определяли с помощью окрашивания трипановым синим и визуализации под микроскопом.

Оценка эффективности трансдукции и фенотипа трансдуцированных Т-клеток мыши с использованием проточной цитометрии. Эффективность трансдукции и оценка фенотипа трансдуцированных и нетрансдуцированных Т-клеток проводилась на 7-е сутки с использованием проточной цитофлуориметрии. 2 - 10⁵ клеток предварительно метили с использованием биотин-конъюгированных антител Affini-Pure F(ab´)₂ (Jackson Immunoresearch, США), инкубировали в течение 20 мин в темноте и дважды отмывали 1 мл раствора PBS с NaN₃. Далее для оценки фенотипа в аликвоты трансдуцированных и нетрансдуцированных Т-клеток добавляли коктейль моноклональных антител мыши и Streptavidin-APC: анти-CD3-Alexa Fluor^® 700, анти-CD4-Brilliant Violet 570^TM, анти-CD8a-PE/Cyanine7, анти-CD44-APC/Cyanine7, анти-CD62L-Alexa Fluor 488, анти-279(PD-1)-Brilliant Violet 421^TM, анти-CD366(TIM- 3)-PE (BioLegend, США). Для выявления клеток с поврежденной мембраной пробы метили витальным красителем 7AAD-PerCP/Cyanine5.5 (BioLegend, США). Пробы инкубировали в течение 30 мин, отмывали 1 мл раствора PBS с NaN₃ и анализировали на проточном цитометре Attune NxT (Thermo Fisher, США).

Оценка цитотоксичности трансдуцированных Т-клеток мыши in vitro. Антиген-специфичную цитотоксичность трансдуцированных Т-клеток мыши оценивали после совместного культивирования с клетками-мишенями, представляющими собой несущие или не несущие целевой антиген опухолевые клеточные линии. Для анализа использовались клеточные линии меланомы мыши B78-21 (GD2-позитивная клеточная линия) и B78-P4 (GD2-негативная клеточная линия) из клеточной коллекции Высшей школы медицины Университета Мие, Япония, которые были любезно предоставлены профессором Х. Шику. Предварительно в 96-луночные плоскодонные планшеты высевали по 4 - 10³ клеток на лунку соответствующих опухолевых линий и инкубировали в течение ночи. Далее полностью заменяли среду и к опухолевым клеткам добавляли по 4 - 10⁴ трансдуцированных или нетрансдуцированных Т-клеток на лунку в соотношении опухоль/эффектор - 1 : 10. После 4-5 ч совместного культивирования забирали по 50 мкл среды для измерения содержания лактатдегидрогеназы (ЛДГ) с использованием коммерческого набора CytoTox 96^® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, США) согласно инструкции производителя.

Оценка экспрессии маркеров цитотоксичности трансдуцированных Т-клеток мыши после сокультивирования с опухолевыми клетками. Трансдуцированные и нетрансдуцированные Т-клетки мыши культивировали совместно с опухолевыми клеточными линиями в течение 4-5 ч. Клетки-мишени предварительно высевали в количестве 4 - 10³ на лунку и инкубировали в течение ночи, затем полностью заменяли среду и добавляли по 4 - 10⁴ трансдуцированных или нетрансдуцированных клеток в соотношении опухоль/эффектор - 1 : 10. По прошествии 4-5 ч совместного культивирования клетки собирали и предварительно метили биотин-конъюгированными антителами Affini-Pure F(ab´)₂ (Jackson Immunoresearch, США), а затем использовали коктейль моноклональных антител мыши и Streptavidin-APC или Streptavidin-PE: анти-CD3-Alexa Fluor^® 700, анти-CD4-Brilliant Violet 570^TM, анти-CD8a-PE/Cyanine7, анти-CD8a-APC/Cyanine7, анти-CD69-Alexa Fluor^® 647, анти-CD107a-PE/Cyanine7, анти-CD137(4-1BB)-PE, анти-CD154(CD40L)-PerCP/Cyanine5.5, анти-CD178(FasL)-PE/Cyanine7 (BioLegend, США). Пробы инкубировали в течение 30 мин, отмывали 1 мл раствора PBS с NaN₃ и анализировали на проточном цитометре Attune NxT.

Оценка противоопухолевой терапии трансдуцированных T-клеток мыши в сингенной модели меланомы in vivo. Для оценки противоопухолевой активности трансдуцированных Т-клеток мыши in vivo самцам или самкам мышей линии C57Bl/6 (n = 18) подкожно в область правого фланка вводили по 2,5 - 10⁶ клеток GD2-позитивной клеточной линии B78-21 в 100 мкл физиологического раствора. При достижении объема опухоли приблизительно 50-100 мм³ мышей разделяли случайным образом на 3 группы по 6 особей: I группа - без проведения лечения; II группа - внутривенное введение 5 - 10⁶ GD2-специфичных CAR-T-клеток; III группа - внутривенное введение 5 - 10⁶ нетрансдуцированных клеток. Объем опухоли рассчитывали по следующей формуле: объем = 0,52 × ширина² × длина. Животных подвергали эвтаназии, если у них проявлялись явные клинические проявления заболевания (отказ от еды, отсутствие активности и ухода за собой, сгорбленная поза) или чрезмерная потеря веса (потеря массы тела > 15 % за 1 нед). Мышей выводили из эксперимента, когда объем опухоли достигал примерно 2000 мм³.

Статистическая обработка данных. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD). Оценка нормальности данных проводилась с использованием теста Шапиро-Уилка. Для определения статистически значимых различий использовалось программное обеспечение GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, США). Полученные данные анализировали подходящими статистическими методами. Использованные статистические методы указаны в подписях к рисункам.

Результаты

Эффективность трансдукции и фенотип трансдуцированных клеток мыши

Эффективность трансдукции GD2-специфичных CAR-T-клеток мыши составила 51,34 ± 2,94 % (среднее и стандартное отклонение, n = 6) с минимумом 47,48 % и максимумом 55,27 %. Схема гейтирования, позволяющая дифференцировать субпопуляции мышиных транс­дуцированных и нетрансдуцированных клеток, представлена на рис. 1.

Среди субпопуляций трансдуцированных клеток наблюдалось преобладание CD8⁺-лимфоцитов (64,69 ± 9,31 %) над CD4⁺-лимфоцитами (25,71 ± 7,47 %). Аналогичная тенденция, хотя и в меньшей степени, прослеживалась в культурах нетрансдуцированных клеток, где CD8⁺-лимфоциты также преобладали (36,96 ± 5,89 % против 17,59 ± 1,93 % CD4⁺-лимфоцитов). Тем не менее относительное количество CD8⁺-лимфоцитов было статистически значимо выше в популяции CAR-T-клеток (рис. 2В). Жизнеспособность клеток, прошедших трансдукцию, в основном варьировала в пределах 70-80 %.

Анализ фенотипа Т-клеток памяти выявил количественное преобладание доли CD44⁺CD62L^--клеток среди общей популяции для трансдуцированных и нетранс­дуцированных CD3⁺-лимфоцитов мыши, что соответствует фенотипу клеток эффекторной памяти (T_EM). При этом доля T_EM в популяции GD2-специфичных CAR-T-клеток была достоверно снижена по сравнению с нетрансдуцированными Т-клетками (74,73 ± 9,69 и 83,97 ± 1,05 % соответственно, среднее и стандартное отклонение) (рис. 2А). Однако среди популяции CAR-T-клеток наблюдалось статистически значимое увеличение доли CD44⁺CD62L⁺-клеток центральной памяти (T_CM) (24,43 ± 9,8 %) по сравнению с нетрансдуцированными Т-клетками (10,43 ± 9,93 %). Доля наивных Т-клеток (T_N), характеризующихся фенотипом CD44^-CD62L⁺, составляла < 1 % от общего пула трансдуцированных клеток.

Исследование экспрессии функциональных маркеров активации и истощения Т-клеток показало, что среди трансдуцированных CD3⁺-лимфоцитов наблюдается увеличение доли клеток, экспрессирующих TIM- 3, по сравнению с нетрансдуцированными клетками (63,05 ± 16,16 и 10,74 ± 1,11 % соответственно, среднее и стандартное отклонение) (рис. 2Б). Что касается PD-1, здесь также наблюдается статистически значимое различие в экспрессии данного маркера между транс­дуцированными и нетрансдуцированными Т-клетками (15,31 ± 7,93 и 28,66 ± 10,02 % соответственно).

Экспрессия маркеров цитотоксичности и активации GD2-специфичными CAR-T-клетками мыши после сокультивирования с клетками-мишенями

Анализ экспрессии маркеров активации (CD69, CD137, CD154) и цитотоксичности (CD107a, CD178) GD2-специфичными CAR-Т-клетками мыши после совместного культивирования с GD2⁺-клетками-мишенями выявил статистически значимое увеличение доли клеток, экспрессирующих CD69, CD107a, CD137 и CD154 по сравнению с нетрансдуцированными клетками (рис. 3А и 3Б). В частности, для трансдуцированных клеток, сокультивированных с GD2-позитивной клеточной линией B78-21, выявлено статистически значимое увеличение доли CD107a⁺-клеток по сравнению с трансдуцированными и нетрансдуцированными клетками, культивируемыми с клетками-мишенями или без них. Экспрессия CD69 также статистически значимо повышалась в транс­дуцированных клетках после контакта с GD2⁺-клетками-мишенями по сравнению с контрольными группами. Доля CD137⁺-клеток была статистически значимо выше во всех группах трансдуцированных CD3⁺-лимфоцитов по сравнению с нетрансдуцированными клетками, независимо от наличия контакта с клетками-мишенями. После сокультивирования CAR-T-клеток с опухолевыми GD2⁺-клетками увеличивалась доля CD154⁺-клеток по сравнению с другими группами Т-клеток. Кроме того, наблюдалась тенденция к увеличению доли CD178⁺-клеток в трансдуцированных культурах.

Цитотоксичность GD2-специфичных CAR-Т-клеток мыши против опухолевых клеточных линий in vitro

Результаты исследования цитотоксичности с использованием метода измерения уровня содержания ЛДГ в кондиционированных средах после совместного культивирования с клетками-мишенями показали, что трансдуцированные клетки проявляют статистически значимую цитотоксичность в отношении GD2-позитивной клеточной опухолевой линии B78-21 по сравнению с нетрансдуцированными Т-клетками (рис. 4). Кроме того, была продемонстрирована антиген-специфическая цитотоксичность CAR-T-клеток, что подтверждается статистически значимым увеличением цитотоксической активности в отношении клеточной линии B78-21 по сравнению с GD2-негативной опухолевой клеточной линией B78-P4.

Оценка эффекта опухолевой супрессии от инфузии GD2-специфичных CAR T-клеток мыши в сингенной модели меланомы in vivo

Исследование in vivo проводилось при достижении оптимального объема опухоли после инокуляции в правый фланк 2,5 - 10⁶ клеток GD2-позитивной клеточной линии меланомы на 14-е сутки. Трансдуцированные (II группа) или нетрансдуцированные Т-клетки (III группа) однократно вводились мышам в хвостовую вену в дозе 5 - 10⁶ клеток на мышь. Введение GD2-специфичных CAR-Т-клеток приводило к выраженной супрессии роста прививаемой опухоли (рис. 5А). На 24-е сутки объем опухоли в контрольной группе (I группа) был статистически значимо выше по сравнению со II группой. Начиная с 4-й недели и до завершения эксперимента наблюдалось статистически значимое различие между экспериментальной II группой и контрольными I и III группами мышей, что свидетельствует о долгосрочном контроле опухоли, опосредованном CAR-T-клетками.

Инфузия GD2-специфичных CAR-T-клеток оказывала выраженный терапевтический эффект, что проявлялось в значительном увеличении продолжительности выживаемости мышей по сравнению с контрольными I и III группами вплоть до 85-го дня перед выведением из эксперимента (при достижении объема опухоли > 2000 мм³) (рис. 5Б). Медиана общей выживаемости II группы составила 61,5 дня, тогда как для I и III групп этот показатель не превышал 33 и 25 дней соответственно.

Обсуждение

В отличие от клеток человека, производство CAR-T-клеток мыши сопряжено с рядом трудностей, связанных с низкой выживаемостью ex vivo и их экспансией [8]. Низкая пролиферативная активность оказывает непосредственное влияние на эффективность трансдукции, поскольку ретровирусы способны проникать только в пролиферирующие клетки [11]. В рамках данного исследования были получены GD2-специфичные CAR-T-клетки мыши с относительно высокой эффективностью трансдукции и жизнеспособностью. Одним из основных источников МНК для производства трансдуцированных клеток мыши является селезенка, однако доля пролиферирующих CD3⁺-лимфоцитов в ней не превышает 25 % [12]. В целях оптимизации процесса трансдукции был использован метод магнитной сепарации фракции МНК с последующим стимулированием выделенных CD3⁺-лимфоцитов с помощью анти-CD3ε/CD28-антител в сочетании с рекомбинантным ИЛ-2 человека [13].

В отличие от установленного соотношения CD4⁺- и CD8⁺-лимфоцитов (приблизительно 2 : 1) в селезенке мышей [14], популяция полученных CAR-T-клеток характеризовалась преобладанием CD8⁺-лимфоцитов. Более того, доля CD8⁺-T-клеток была значительно увеличена по сравнению с активированными нетрансдуцированными клетками. Принимая во внимание эффекты GITRL, усиливающего пролиферацию Т-клеток [15], и стимуляции CD3ε и CD28, способствующей дифференцировке в сторону CD8⁺-Т-клеток [13], можно предположить, что использованная комбинация активации анти-CD3ε/CD28-антителами и ретровирусной трансдукции вектором, кодирующим CAR-рецептор и GITRL, оказывает комплексное влияние на популяцию Т-лимфоцитов. В частности, GITRL может способствовать увеличению общего количества Т-клеток, в то время как стимуляция CD3ε и CD28 смещает процесс дифференцировки CD3⁺-лимфоцитов в сторону CD8⁺-лимфоцитов, приводя к увеличению их относительного содержания.

В соответствии с экспрессией поверхностных клеточных маркеров CD44 и CD62L, популяция Т-клеток мышей может быть разделена на 3 основные субпопуляции: CD44⁺CD62L⁺-клетки центральной памяти (T_CM), CD44⁺CD62L^--клетки эффекторной памяти (T_EM) и CD44^-CD62L⁺-наивные клетки (T_N) [16, 17]. Среди CAR-T-клеток мыши преобладают CD44⁺CD62L^--T_EM, при этом наблюдается увеличение доли CD44⁺CD62L⁺- T_CM по сравнению с нетрансдуцированными Т-клетками. Отмечается, что T_CM обладают рядом функциональных свойств, превосходящие как таковые у T_EM, что может способствовать усилению противоопухолевого иммунитета in vivo, особенно в контексте адоптивной терапии [18]. Наряду с этим наблюдается уменьшение доли CD44^-CD62L⁺- T_N как в популяции нетрансдуцированных Т-клеток, так и в популяции CAR-T-клеток. Однако, согласно данным литературы, преобладающая доля выделенных из селезенки Т-клеток состоит преимущественно из T_N [17]. Таким образом, изменение субпопуляционного состава полученных Т-клеток может быть обусловлено применяемым протоколом, включающим активацию с помощью анти-CD3ε/CD28-антител и продолжительный период культивирования клеток, что приводит к дифференцировке T_CM и T_EM, а ретровирусная трансдукция, в свою очередь, способствует увеличению доли CD44⁺CD62L⁺- T_CM.

Анализ экспрессии маркеров активации и клеточного истощения выявил увеличение доли TIM-3⁺-клеток, подвергшихся ретровирусной трансдукции, что представляет интерес для понимания механизмов активации трансдуцированных клеток мыши. Полученные результаты согласуются с данными о сверхэкспрессии маркера TIM-3 в Т-клетках человека после первичной активации и трансдукции вирусным вектором, кодирующим CAR-рецептор [19]. Предполагается, что повышение экспрессии TIM-3 отражает чрезмерную активацию трансдуцированных клеток, что, в свою очередь, влияет на их функциональные свойства. Учитывая роль TIM-3 в регуляции синтеза провоспалительных цитокинов путем инициации сигнального каскада в эффекторных Т-клетках [20], трансдукция CAR-рецептором не только обеспечивает активацию CAR-T-клеток без дополнительной стимуляции, но и, вероятно, усиливает их цитотоксический потенциал за счет накопления провоспалительных молекул, необходимых для эффективного уничтожения клеток-мишеней. Действительно, включение костимулирующего домена CD28 в конструкцию CAR усиливает цитокин-продуцирующие функции трансдуцированных клеток [5], а также приводит к повышению экспрессии маркеров истощения [21]. Однако доля клеток, экспрессирующих PD-1, была ниже в популяции трансдуцированных клеток по сравнению с нетрансдуцированными. Поскольку экспрессия PD-1 регулируется сигналами, исходящими от клеточного рецептора [22], можно предположить, что модификация Т-клеток с помощью CAR-рецептора изменяет сигнальные пути, влияющие на экспрессию PD-1. Кроме того, известно, что взаимодействие GITR/GITRL защищает Т-клетки от анти-CD3-индуцированного апоптоза [15], что также может способствовать снижению экспрессии PD-1. В дополнение, снижение сигналов PD-1, как было показано ранее [23], связано с формированием клеток памяти, включая сдвиг в сторону T_CM. Это согласуется с наблюдаемым увеличением доли CD44⁺CD62L⁺-T_CM в популяции трансдуцированных клеток.

Для подтверждения специфической активации CAR-T-клеток в ответ на распознавание целевого антигена была проанализирована экспрессия маркеров активации CD69, CD137 и CD154 [24, 25]. С целью определения, чем является экспрессия маркеров: результатом специфического распознавания или следствием эффекта ретровирусной трансдукции, трансдуцированные и нетрансдуцированные клетки культивировались с клетками-мишенями или без них. Результаты показали, что исследуемые CAR-Т-клетки обладают способностью специфически распознавать целевой антиген, поскольку экспрессия CD69, CD137 и CD154 увеличивалась после контакта с GD2⁺-клетками-мишенями. Несмотря на то что CD69 является маркером ранней активации и участвует в противоопухолевом иммунном ответе, регулируя секрецию цитокинов и миграцию Т-клеток, его повышенная экспрессия также может быть связана с истощением [26, 27].

В связи с этим обнаруженная тенденция к увеличению доли CD69⁺-CAR-T-клеток может указывать на индукцию тонической передачи сигналов от CAR-рецептора, которая ассоциирована с приобретением статуса истощения [28]. Учитывая сопоставимость времени культивирования с периодом экспрессии CD69 [26], необходимо дальнейшее изучение влияния этого маркера на истощение CAR-T-клеток мыши. В отношении CD137 и CD154 было установлено, что экспрессия данных маркеров увеличивалась в транс­дуцированных клеточных культурах независимо от наличия клеток-мишеней, что может указывать на влияние ретровирусной трансдукции. Предполагается, что встроенный в CAR-рецептор домен CD28 способствует повышению экспрессии CD137, однако, поскольку CD28 влияет на экспрессию CD137 на ранних этапах активации Т-клеток [28], остается открытым вопрос о временном характере этой экспрессии. Важно также отметить, что CD137 и CD154 играют важную роль в активации Т-клеток в противоопухолевом иммунитете. В частности, 4-1BB, как известно, способствует выведению лимфоцитов из статуса истощения [29], а CD40L является мощным активатором антиген-презентирующих клеток и способствует усилению противоопухолевого Т-клеточного ответа в сингенных моделях на мышах [30].

В результате анализа маркеров цитотоксичности было обнаружено увеличение экспрессии CD107a, маркера дегрануляции, CAR-T-клетками после контакта с GD2⁺-опухолевыми клетками. Мембранная экспрессия CD107a отражает процесс цитотоксической грануляции Т-клеток, высвобождающих предварительно сформированные цитотоксические гранулы, содержащих перфорин и гранзимы, и также является показателем распознавания целевой клетки [31]. Наблюдаемое усиление цитотоксичности трансдуцированных клеток согласуется с увеличением экспрессии TIM-3, который инициирует синтез провоспалительных цитокинов и, возможно, литических молекул, однако необходимы дальнейшие исследования для подтверждения участия TIM-3 в регуляции цитотоксичности в данной системе. На клеточной поверхности трансдуцированных культур также прослеживалась тенденция к повышению экспрессии FasL, который является индуктором Fas-опосредованного апоптоза, представляющего собой один из механизмов T-клеточной элиминации опухолевых клеток [5].

Анализ in vitro выявил, что трансдуцированные Т-клетки проявляют повышенную цитотоксичность в отношении клеток-мишеней по сравнению с нетрансдуцированными клетками, а также демонстрируют антиген-специфические свойства. Несмотря на то что цитотоксическая активность CAR-T-клеток мыши значительно ниже клеток человека, что требует более высоких концентраций эффекторных клеток [8], наблюдалась выраженная цитотоксичность трансдуцированных клеток даже при соотношении эффектор/мишень - 10 : 1. Предположительно, это связано с тем, что исследуемая в данной работе конструкция CAR-рецептора содержит улучшенный и стабилизированный scFv (полученный из мышиного моноклонального антитела 220-51), который обеспечивает повышенную аффинность и, следовательно, выраженную антиген-специфическую цитотоксичность, особенно при ограниченном количестве эффекторных клеток. Подтверждением антиген-специфичности scFv является анализ маркеров активации и цитотоксичности, демонстрирующий схожие закономерности при том же соотношении эффектор/мишень.

В работе была оптимизирована экспериментальная модель меланомы B78-21 для исследования противоопухолевого эффекта трансдуцированных клеток in vivo. Оптимальные параметры модели включали подкожную инокуляцию опухолевых клеток в концентрации 2,5 - 10⁶ клеток на мышь с последующим введением CAR-T-клеток через 2 нед после инокуляции, когда опухоль достигала необходимого объема для проведения терапии.

Принимая во внимание, что в клинических испытаниях доза GD2-специфичных CAR-T-клеток человека варьирует в диапазоне от 1 до 3 - 10⁶ клеток на 1 кг массы тела [32], а также учитывая, что трансдуцированные клетки мышей уступают по цитотоксичности клеткам человека [8], в настоящем исследовании мышам-носителям солидной опухоли вводили CAR-T-клетки в дозе 5 - 10⁶ клеток на мышь. При этом не выявлено симптомов, характерных для нейротоксичности и "цитокинового шторма" [9, 33]. Однократное введение GD2-специфичных CAR-T-клеток приводило к значительному сдерживанию роста опухолевого узла и увеличению продолжительности общей выживаемости мышей-опухоленосителей (медиана вдвое выше, чем в контрольных группах) вплоть до 85 дней. Таким образом, используемый в исследовании ретровирусный вектор, кодирующий CAR-рецептор и GITRL, позволил добиться значительного противоопухолевого эффекта in vivo при отсутствии выраженных побочных эффектов.

Заключение

В ходе проведенного исследования были получены CAR-Т-клетки мыши, обладающие фенотипом, который необходим для эффективной противоопухолевой терапии, и демонстрирующие антиген-специфичес­кие свойства как в отношении GD2-позитивных клеточных опухолевых линий in vitro, так и в сингенной модели меланомы B78-21 in vivo. Эффективность транс­дуцированных клеток мыши в терапии солидной опухоли подчеркивает важность дальнейших исследований в иммунокомпетентных моделях, что позволит лучше понять механизмы противоопухолевого ответа и, следовательно, будет способствовать усовершенствованию существующих протоколов оптимизации GD2-специфичных CAR-T-клеток человека для успешного проведения клинических исследований.

Литература

1. Maude S.L., Laetsch T.W., Buechner J., Rives S., Boyer M., Bittencourt H. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-Cell lymphoblastic leukemia. N. Engl. J. Med. 2018; 378 (5): 439-48. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMoa1709866

2. Sadelain M., Brentjens R., Riviere I. The basic principles of chimeric antigen receptor (CAR) design. Cancer Discov. 2013; 3 (4): 388-98. DOI: https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-12-0548

3. Yang X., Wang G.X., Zhou J.F. CAR T Cell therapy for hematological malignancies. Curr. Med. Sci. 2019; 39 (6): 874-82. DOI: https://doi.org/10.1007/s11596-019-2118-z

4. Киселевский М.В., Чикилева И.О., Ситдикова С.М., Власенко Р.Я., Караулов А.В. Перспективы применения генетически модифицированных лимфоцитов с химерным Т-клеточным рецептором (CAR-T-клеток) для терапии солидных опухолей. Иммунология. 2019; 40 (4): 48-55. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-14006

5. Philippova J., Shevchenko J., Sennikov S. GD2-targeting therapy : a comparative analysis of approaches and promising directions. Front. Immunol. 2024; 15: 1-27. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2024.1371345

6. Cheng M., Ahmed M., Xu H., Cheung N.K. Structural design of disialoganglioside GD2 and CD3-bispecific antibodies to redirect T cells for tumor therapy. Int. J. Cancer. 2015; 136 (2): 476-86. DOI: https://doi.org/10.1002/ijc.29007

7. Лопатникова Ю.А., Шевченко Ю.А., Филиппова Ю.Г., Фишер М.С., Облеухова И.А., Завьялов Е.Л., Соловьева О.И., Разумов И.А., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Разработка экспериментальных моделей ксенотрансплантата опухолей человека на мышах для доклинических исследований in vivo препаратов для клеточной иммунотерапии. Иммунология. 2023; 44 (6): 709-20. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-6-709-720

8. Ahmed E.N., Cutmore L.C., Marshall J.F. Syngeneic mouse models for pre-clinical evaluation of CAR T cells. Cancers (Basel). 2024; 16 (18): 3186. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers16183186

9. Duncan B.B., Dunbar C. E., Ishii K. Applying a clinical lens to animal models of CAR-T cell therapies. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2022; 27: 17-31. DOI: https://doi.org/10.1016/j.omtm.2022.08.008

10. Филиппова Ю.Г., Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Терещенко В.П., Фишер М.С., Курилин В.В., Пашкина Е.А., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Фенотип и эффекторные функции GD2-специфичных CAR-T-клеток in vitro. Иммунология. 2022; 43 (5): 525-35. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-525-535

11. Hu B., Ren J., Luo Y., Keith B., Young R.M., Scholler J., Zhao Y., June C.H. Augmentation of antitumor immunity by human and mouse CAR T cells secreting IL-18. Cell Rep. 2017; 20 (13): 3025-33. DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.09.002

12. Pinchuk L.M., Filipov N.M. Differential effects of age on circula­ting and splenic leukocyte populations in C57BL/6 and BALB/c male mice. Immun. Ageing. 2008; 5: 1. DOI: https://doi.org/10.1186/1742-4933-5-1

13. Lanitis E., Rota G., Kosti P., Ronet C., Spill A., Seijo B., Romero P., Dangaj D., Coukos G., Irving M. Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of IL-15 coexpression. J. Exp. Med. 2021; 218 (2): e20192203. DOI: https://doi.org/10.1084/jem.20192203

14. McLellan A.D., Kapp M., Eggert A., Linden C., Bommhardt U., Bröcker E.B., Kämmerer U., Kämpgen E. Anatomic location and T-cell stimulatory functions of mouse dendritic cell subsets defined by CD4 and CD8 expression. Blood. 2002; 99 (6): 2084-93. DOI: https://doi.org/10.1182/blood.v99.6.2084

15. Tian J., Zhang B., Rui K., Wang S. The role of GITR/GITRL Interaction in autoimmune diseases. Front. Immunol. 2020; 11: 588682. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.588682

16. Nakajima Y., Chamoto K., Oura T., Honjo T. Critical role of the CD44^lowCD62L^low CD8⁺ T cell subset in restoring antitumor immunity in aged mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2021; 118 (23): e2103730118. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.2103730118

17. Skordos I., Demeyer A., Beyaert R. Analysis of T cells in mouse lymphoid tissue and blood with flow cytometry. STAR Protoc. 2021; 2 (1): 100351. DOI: https://doi.org/10.1016/j.xpro.2021.100351

18. Klebanoff C.A., Gattinoni L., Torabi-Parizi P., Kerstann K., Cardones A.R., Finkelstein S.E., Palmer D.C., Antony P.A., Hwang S.T., Rosenberg S.A., Waldmann T.A., Restifo N.P. Central memory self/tumor-reactive CD8⁺ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102 (27): 9571-6. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.0503726102

19. Jafarzadeh L., Masoumi E., Mirzaei H.R., Alishah K., Fallah-Mehrjardi K., Khakpoor-Koosheh M., Rostamian H., Noorbakhsh F., Hadjati J. Targeted knockdown of Tim3 by short hairpin RNAs improves the function of anti-mesothelin CAR T cells. Mol. Immunol. 2021; 139: 1-9. DOI: https://doi.org/10.1016/j.molimm.2021.06.007

20. Булыгин А.С., Филиппова Ю.Г., Алсаллум А., Алрхмун С., Киреев Ф.Д., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Перик-Заводский Р.Ю., Перик-Заводская О.Ю., Назаров К.В., Шику Х., Голикова Е.А., Облеухова И.А., Силков А.Н., Сенников С.В. Фенотип и продукция цитокинов TCR-подобными CAR/CAR/TCR-T-клетками при контакте со сфероидами опухолевых клеток в культуре in vitro. Иммунология. 2025; 46 (1): 51-61. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2025-46-1-51-61

21. Wherry E.J. T cell exhaustion. Nat Immunol. 2011; 12 (6): 492-9. DOI: https://doi.org/10.1038/ni.2035

22. Simon S., Labarriere N. PD-1 expression on tumor-specific T cells: Friend or foe for immunotherapy? Oncoimmunology. 2017; 7 (1): e1364828. DOI: https://doi.org/10.1080/2162402X.2017.1364828

23. Pauken K.E., Godec J., Odorizzi P.M., Brown K.E., Yates K.B., Ngiow S.F., Burke K.P., Maleri S., Grande S.M., Francisco L.M., Ali M.A., Imam S., Freeman G.J., Haining W.N., Wherry E.J., Sharpe A.H. The PD-1 pathway regulates development and function of memory CD8⁺ T cells following respiratory viral infection. Cell Rep. 2020; 31 (13): 107827. DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.107827

24. Atar D., Mast A.S., Scheuermann S., Ruoff L., Seitz C.M., Schlegel P. Adapter CAR T cell therapy for the treatment of B-lineage lymphomas. Biomedicines. 2022; 10 (10): 2420. DOI: https://doi.org/10.3390/biomedicines10102420

25. Dragon A.C., Zimmermann K., Nerreter T., Sandfort D., Lahr­berg J., Klöß S., Kloth C., Mangare C., Bonifacius A., Tischer-Zimmermann S., Blasczyk R., Maecker-Kolhoff B., Uchanska-Ziegler B., Abken H., Schambach A., Hudecek M., Eiz-Vesper B. CAR-T cells and TRUCKs that recognize an EBNA-3C-derived epitope presented on HLA-B*35 control Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferation. J. Immunother. Cancer. 2020; 8 (2): e000736. DOI: https://doi.org/10.1136/jitc-2020-000736

26. Cibrián D., Sánchez-Madrid F. CD69: from activation marker to metabolic gatekeeper. Eur. J. Immunol. 2017; 47 (6): 946-53. DOI: https://doi.org/10.1002/eji.201646837

27. Koyama-Nasu R., Wang Y., Hasegawa I., Endo Y., Nakayama T., Kimura M.Y. The cellular and molecular basis of CD69 function in anti-tumor immunity. Int. Immunol. 2022; 34 (11): 555-61. DOI: https://doi.org/10.1093/intimm/dxac024

28. Habib-Agahi M., Jaberipour M., Searle P.F. 4-1BBL costimulation retrieves CD28 expression in activated T cells. Cell Immunol. 2009; 256 (1-2): 39-46. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cellimm.2009.01.003

29. Long A.H., Haso W.M., Shern J.F., Wanhainen K.M., Murgai M., Ingaramo M., Smith J.P., Walker A.J., Kohler M.E., Venkateshwara V.R., Kaplan R.N., Patterson G.H., Fry T.J., Orentas R.J., Mackall C.L. 4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signa­ling of chimeric antigen receptors. Nat. Med. 2015; 21 (6): 581-90. DOI: https://doi.org/10.1038/nm.3838

30. Kuhn N.F., Purdon T.J., van Leeuwen D.G., Lopez A.V., Curran K.J., Daniyan A.F., Brentjens R.J. CD40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 2019; 35 (3): 473-88. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ccell.2019.02.006

31. Lorenzo-Herrero S., Sordo-Bahamonde C., Gonzalez S., López-Soto A. CD107a degranulation assay to evaluate immune cell antitumor activity. Methods Mol. Biol. 2019; 1884: 119-30. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8885-3_7

32. Testa U., Castelli G., Pelosi E. CAR-T Cells in the treatment of nervous system tumors. Cancers (Basel). 2024; 16 (16): 2913. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers16162913

33. Giavridis T., van der Stegen S.J.C., Eyquem J., Hamieh M., Piersigilli A., Sadelain M. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by IL-1 blockade. Nat. Med. 2018; 24 (6): 731-8. DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-018-0041-7

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)