Введение
Изучение функционирования иммунной системы в условиях прогрессирования злокачественных новообразований позволяет разрабатывать новые подходы терапевтических стратегий. В настоящее время в качестве адъювантной терапии применяют различные способы стимуляции иммунокомпетентных клеток (ИКК). Активация врожденного иммунного ответа как первой линии защиты и фактора, инициирующего адаптивный ответ, имеет решающее значение в эффективности иммунитета против злокачественных клеток. Активная неспецифическая иммунотерапия с использованием нецитокиновых адъювантов направлена на инициацию и повышение функций широкого спектра различных типов ИКК.
Мурамилдипептиды (МДП) - фрагменты пептидогликана клеточной стенки бактерий, обладающие иммуномодулирующей способностью. МДП относятся к патоген-ассоциированным молекулам (PAMP - pathogen-associated molecular patterns). Они являются лигандами образ-распознающих сигнальных рецепторов (PRR - pattern-recognition receptors) и, связываясь с внутриклеточными NOD-рецепторами, приводят к активации NF-kB сигнального пути и, как следствие, к синтезу провоспалительных цитокинов, которые активируют функции клеток противоопухолевой защиты. NOD2 экспрессируются многими типами клеток, в том числе натуральными киллерными (НК) клетками, а также макрофагами, гранулоцитами, дендритными клетками и различными типами неиммунных клеток.
ГМДП (глюкозаминилмурамилдипептид, лекарственный препарат Ликопид®, АО "Пептек") - полусинтетический аналог МДП, дополненный остатком N-ацетилглюкозамина, имеет сходные с МДП биологические свойства, но при этом обладает рядом преимуществ: менее токсичен и проявляет более выраженную противоопухолевую и адъювантную активность. Аналог ГМДП - ГМДП-А (N-глюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовая кислота) имеет еще менее выраженную пирогенность и увеличенный период полувыведения, что позволяет использовать его в виде инъекционной лекарственной формы и уменьшить кратность его назначения [1].
НК-клетки являются элементами первой линии защиты от появления и распространения опухолевых клеток в организме. Они реализуют ранние этапы формирования врожденного иммунного ответа на инфицированные и трансформированные злокачественные клетки [2, 3]. НК-клетки могут распознавать клетки-мишени, включая опухолевые, со сниженной экспрессией MHC класса I и идентифицировать молекулы, которые не экспрессируются в нормальных клетках, но активируются в трансформированных. НК-клетки разделяют на 2 субтипа: CD56dimCD16+ обладают цитотоксической активностью, индуцируя лизис опухолевых клеток через высвобождение перфорина и гранзимов, CD56brightCD16- продуцируют целый ряд цитокинов, таких как ИЛ-2, ИФН-α и ИФН-γ, ФНО-α, ИЛ-12, ИЛ-18, ГМ-КСФ, хемокины и др., что позволяет им модулировать функции других типов ИКК и являться связующим звеном с клетками адаптивного звена иммунного ответа [4].
Перфорин-зависимый цитолиз является ключевым механизмом цитотоксичности НК-клеток против опухолевых клеток. Показано, что перфорин предотвращает инициацию, рост и метастазирование опухолевых клеток [5-8]. НК-клетки конститутивно продуцируют ИФН-γ, который, с одной стороны, стимулирует функции самих НК-клеток, с другой - играет центральную роль во врожденном и адаптивном иммунных ответах, а также является связующим звеном между НК- и другими ИКК [9]. Причем показано, что продукция перфорина и ИФН-γ НК-клетками - это два независимых и одновременно потенцирующих друг друга механизма участия НК-клеток в борьбе против опухолевых клеток. Так, в модели спонтанно метастазирующей опухоли карциномы молочной железы DA3 у мышей BALB/c показано, что у мышей, дефицитных по одному из генов перфорина или ИФН-γ, количество метастазов в легких превышало количество таковых у дикого типа мышей, а дефицит обоих генов в НК-клетках приводил к максимальному количеству метастазов в легких, при этом у мышей дефицитных по Т- и НКТ-клеткам количество метастазов не увеличивалось [5]. В работе [10] показано, что снижение уровня продукции ИФН-γ, генерация генетических дефектов факторов передачи сигнала ИФН-γ, включая полиморфизм его рецептора IFNGR2, является фактором риска и негативного прогноза для рака ободочной и прямой кишки. Связывание ИФН-γ со своими рецепторами R1 и R2 на поверхности клеток ассоциировано с активацией JAK1 и JAK2, соответственно, что приводит к запуску каскада, включающего активацию протеинкиназ (MAPK), фосфорилирование и транслокацию STAT1 и STAT3 в ядро клетки, и связывание с ИФНγ-активирующим сайтом (GAS), что вызывает инициацию транскрипции генов, вовлеченных в противоопухолевый иммунитет: МНС I класса, CD95, каспазы-1 и других генов, ассоциированных с подавлением опухолевого роста [11].
Интерлейкин-18 (ИЛ-18) - провоспалительный цитокин, изначально был описан как ИФН-γ-индуцирующий фактор (IGIF) [12]. Однако впоследствии было показано, что ИЛ-18 вовлечен в целый ряд процессов, влияющих на различные этапы и механизмы функционирования многих типов клеток, в том числе и НК-клеток. Так, ИЛ-18 активирует пролиферацию, созревание и цитотоксичность НК-клеток, индуцируя транскрипцию генов и синтез протеинов, вовлеченных в этот процесс, а также выживаемость клеток и процесс аутофагии [13]. Цитолитическая активность ИЛ-18 опосредована через активацию продукции ИФН-γ и перфорина НК-клетками [14]. В эксперименте на мышах с нокаутом гена ИЛ-18 показано, что в присутствии ИЛ-18 увеличивается грануляция и размер НК-клеток, что является интегральным показателем их активации, в том числе усиления продукции рибосомальных протеинов, пролиферации (старт G2/M фазы клеточного цикла) [15], а также увеличения экспрессии различных поверхностных молекул (CD69, c-kit, IL-2R, факторов аутофагии: ATG5, LC3-II, p62) [13, 16]. Кроме того, снижая активность апопто-тических митохондриальных каспазы-3 и каспазы-9, а также индуцируя продукцию ФНО и, соответственно, с-апопототического ингибитора 2 (cIAP2) и фактора 1, ассоциированного с рецептором ФНО (TRAF1), ИЛ-18 защищает НК-клетки от аутодеструкции, инициирующейся в процессе цитотоксичности этих клеток [17]. Все описанные эффекты ИЛ-18 осуществляются через связывание с α- и β-цепями рецептора ИЛ-18 на поверхности НК-клеток и последующую активацию MyD88 и NF-κB. Кроме того, ИЛ-18 вызывает увеличение экспрессии рецептора ИЛ-2 (особенно CD25), передачи сигнала на STAT3/STAT5 и инициацию пролиферации клеток [18].
Иммуносупрессия, индуцированная злокачественным процессом, отражается на функции всех ИКК, в том числе на активности НК-клеток. Например, показано, что у пациентов с раком легкого в Т-, НК- и НКТ-клетках, инфильтрирующих опухоль, снижена экспрессия перфорина, гранзима В и ИФН-γ [19]. Существует несколько механизмов и причин супрессии НК-клеток. Так, микроокружение опухоли состоит из опухолеассоциированной стромы и иммунных клеток, взаимодействующих с опухолью [опухоль-ассоциированные макрофаги, толерогенные дендритные клетки и Т-регуляторные лимфоциты (Трег)]. Эти клетки способны продуцировать растворимые лиганды, супрессорные молекулы и цитокины, которые негативно влияют на созревание и активность НК-клеток. Так, Трег продуцируют противовоспалительные факторы ТФР-β и ИЛ-10, что приводит к снижению активности НК-клеток [20]. НК-клетки экспрессируют множество рецепторов, которые модулируют их функции, в частности цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам. К ним относятся НК-специфические рецепторы, называемые рецепторами естественной цитотоксичности (NCRs), представленные NKp30, NKp44 и NKp46. NCR действуют совместно с другими активирующими распознавание МНС-1 на стрессированных клетках рецепторами, такими как NKG2D и DNAM-1. Эти лиганды активируются при опухолевой трансформации клеток и во время вирусной инфекции [21]. Некоторые типы опухолевых клеток способны продуцировать растворимый рецептор NKG2D, что также негативно отражается на функции НК-клеток, снижая их цитотоксическую активность [22, 23]. Кроме того, некоторые химиотерапевтические и антинеопластические препараты также угнетают функцию НК-клеток. Так, 5-фторурацил (5-fluo-rouracil), цисплатин, 5-аза-2'-деоксицитидин, трихоста-тин A, бриостатин-1 повышают экспрессию NKG2DL в опухолевых клетках [24]. Поэтому одной из перспективных стратегий элиминации опухолевых клеток и активации противоопухолевого иммунного ответа в настоящее время служит активизация функционирования НК-клеток.
Цель данного исследования - изучение влияния ГМДП-А на функциональную активность НК-клеток, в частности, на экспрессию генов перфорина, ИФН-γ и его рецепторов, рецептора ИЛ-18, а также на цитотоксическую активность НК-клеток в отношении опухолевой клеточной линии колоректальной аденокарциномы человека НТ-29 in vitro.
Материал и методы
Характеристика исследуемого агента
ГМДП-А - N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовая кислота (производитель - ЗАО "Пептек", Москва, Россия). ГМДП-А использовали в дозах 1 и 5 мкг/мл.
Характеристика клеточной линии
Клетки колоректальной аденокарциномы человека НТ-29 (код АТСС - НТВ38) были получены из коллекции клеточных линий ФГБУ "Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева" Минздрава России.
Подготовка клеток-мишеней
Клетки HT-29 культивировали в полной среде DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Hyclone, США), 1 мг/мл глутамина (ПанЭко, Россия), 50 Ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия) при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СО2. После достижения монослоя клетки промывали раствором Версена и открепляли от пластика трипсином (0,25% в растворе Версена). Количество клеток подсчитывали с использованием камеры Горяева и рассевали клетки исходя из расчета 100 тыс. клеток на 1 см2. За 48 ч до проведения эксперимента клетки HT-29, достигшие монослоя, отделяли от подложки, как описано выше, и рассевали в полной среде DMEM, содержащей 0,1 мкКюри метил-3Н-тимидина, при плотности 100 тыс. клеток на 1 см2. Клетки культивировали 2 суток, до достижения 80-90% плотности монослоя, затем отделяли от подложки 0,25% трипсином в растворе Версена. После подсчета клеток последние рассевали в лунки 96-луночного планшета (SPL Lifesciences, Южная Корея) в количестве 8000 клеток на лунку и культивировали 4-6 ч до проведения эксперимента при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СО2.
Подготовка клеток-эффекторов
В качестве клеток-эффекторов использовали мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови 25 здоровых доноров мужского пола, в возрасте от 24 до 35 лет. Венозную кровь, стабилизированную К3ЭДТА, смешивали с равным объемом фосфатно-солевого буфера, наслаивали на градиент плотности фиколлверографина (1,077) и центрифугировали 25 мин при 1000g. После окончания центрифугирования клетки, собранные на границе градиента плотности, ресуспензировали в среде RPMI-1640 без сыворотки и центрифугировали 8 мин при 200g. Эту процедуру повторяли еще дважды. Выделенные и отмытые МНК ресуспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина, подсчитывали в камере Горяева.
Выделенные клетки помещали в лунки 24-луночного планшета (SPL Lifesciences, Южная Корея) при плотности 2 млн/мл в объеме 1 мл полной среды RPMI-1640. В опытные лунки вносили ГМДП-А в концентрации 1 и 5 мкг/мл. В контрольные лунки вносили эквивалентный объем питательной среды. После внесения препарата клетки инкубировали при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СО2, в течение 12 ч.
Определение цитотоксической активности
Для оценки цитотоксической активности НК клетки опухолевой линии НТ-29 предварительно метили 3Н-тимидином (1 мКю/лунку) в течение 18 ч, отмывали и культивировали в 96-луночных планшетах (104/лунку). Эффекторные клетки (МНК) добавляли в соотношении 20:1 и 10:1. В опытные лунки вносили ГМДП-А в концентрации 1 и 5 мкг/мл. В контрольные лунки вносили эквивалентный объем питательной среды. После внесения препарата клетки инкубировали при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СО2, в течение 12 ч. Затем клетки переносили на фильтры и оценивали радиоактивность на β-счетчике (Rackbeta, США). На каждую экспериментальную точку использовали по 3-4 лунки. Контролем служили лунки с мечеными 3Н-тимидином НТ-29, культивируемые в отсутствии МНК. Результаты выражали в виде индекса цитотоксичности (ИЦ) в процентах (%). Расчет ИЦ проводился по формуле:
&hide_Cookie=yes)
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы IBM SPPS.
Выделение субпопуляции НК-клеток
Выделение НК-клеток осуществляли из клеток периферической крови 5 здоровых доноров мужского пола в возрасте от 24 до 35 лет методом магнитной сепарации с использованием набора #130-092-657 и оборудования производства компании Miltenyi Biotec (Германия), согласно прилагаемому к набору протоколу. По данным цитофлюориметрического анализа чистота выделенной популяции НК-клеток (CD3-CD19-CD56+) составляла 93-97%.
Выделенные клетки помещали в лунки 24-луночного планшета (SPL Lifesciences, Южная Корея) при плотности 1 млн/мл в полной среде RPMI-1640. В опытные лунки вносили ГМДП-А в концентрации 10 мкг/мл. В контрольные лунки вносили эквивалентный объем питательной среды. После внесения препарата клетки инкубировали при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СО2, в течение 6 и 16 ч.
Выделение РНК и реакция обратной транскрипции (ОТ-ПЦР)
По окончании культивирования НК-клеток из лунок осторожно удаляли 0,4 мл среды культивирования и добавляли 0,8 мл Trizol Reagent (Invitrogen, США). Далее следовали протоколу производителя. Сразу после выделения суммарной РНК проводили реакцию обратной транскрипции с использованием набора Ambion TotalPrep cRNA Amplification Kit (Invitrogen, США), согласно протоколу, прилагаемому к набору. Уровень экспрессии генов исследовали с использованием набора Illumina HumanHT-12v4 Expression BeadChip (Illumina, США) на приборе Illumina iScan (Illumina, США) согласно протоколу производителя. Полученные данные обрабатывали с помощью пакета прикладных программ Genome Studio Software (v 2011.1, Illumina).
Результаты
Влияние ГМДП-А на цитолитическую активность НК-клеток в отношении клеток опухолевой линии HT-29
Исследовали образцы МНК, выделенные из периферической крови 25 здоровых доноров мужского пола в возрасте от 24 до 35 лет. В качестве клеток-мишеней использовали клеточную линию аденокарциномы толстой кишки человека НТ-29, чувствительную к цитолитической активности НК-клеток. Клетки-мишени и клетки-эффекторы использовали в соотношении 1:10 и 1:20. ГМДП-А использовали в качестве стимулятора функциональной активности клеток фракции МНК в дозах 1 и 5 мкг/мл.
Показано, что добавление ГМДП-А к клеткам, культивированным в соотношении 1:10 в дозах 1 и 5 мкг/мл, приводит к увеличению выраженности цитолиза НТ-29 с 19,7 ± 1,5% в группе сравнения до 48,8 ± 2,01 и 57,1 ± 4,7% в опытной группе соответственно (табл. 1). При культивировании клеток НТ-29 и МНК в соотношении 1:20 показатель индекса цитотоксичности на фоне добавления ГМДП-А (в дозах 1 и 5 мкг/мл) увеличился, но был выражен несколько меньше (52,4 ± 4,1 и 56,1 ± 3,9% соответственно) по сравнению с группой, где соотношение клеток 1:10, что, видимо, связано со сравнительно высоким уровнем цитолиза в группе сравнения без дополнительной стимуляции (38,5 ± 3,2%). Иными словами, культивирование МНК здоровых доноров в присутствии ГМДП-А приводит к значительному увеличению их функциональной активности и цитотоксической активности НК-клеток в отношении клеток НТ-29.
&hide_Cookie=yes)
Экспрессия генов перфорина, ИФН-γ, рецепторов ИФН-γ (R1, R2) и ИЛ-18 в НК - клетках
Исследование экспрессии генов перфорина, ИФН-γ и его рецепторов R1 и R2, а также рецептора ИЛ-18 проводили в чистой фракции НК-клеток (93-97%), полученных от здоровых доноров, без дополнительной стимуляции (группа сравнения) и под влиянием стимуляции ГМДП-А (10 мгк/мл) в течение 6 или 16 ч культивирования.
Анализ тестируемого транскриптома НК-клеток продемонстрировал статистически значимое увеличение уровня экспрессии перфорина у всех 5 доноров через 16 ч культивирования в присутствии ГМДП-А и у 2 доноров из 5 наблюдалось увеличение экспрессии гена перфорина через 6 ч культивирования. При изучении влияния ГМДП-А на экспрессию генов ИФН-γ и его рецепторов 1-го и 2-го типов в чистой фракции НК-клеток здоровых доноров было показано, что в данной экспериментальной модели ГМДП-А не изменяет их уровень. При этом обнаружено значительное увеличение экспрессии рецептора ИЛ-18 на НК-клетках в присутствии ГМДП-А, причем более значительное увеличение наблюдалось на ранних сроках культивирования (через 6 ч) у всех 5 доноров (табл. 2).
&hide_Cookie=yes)
Обсуждение
МДП и их синтетические производные (ГМДП и ГМДП-А) как иммуноактивные гликопептиды бактериальной природы реализуют свои эффекты через связывание с рецептором ЛПС - CD14, рецепторами 5-НТ и TLR, а также через специфические для них цитоплазматические рецепторы NOD1 и 2 [25, 26]. МДП и его синтетические аналоги стимулируют различные функции иммунных клеток, повышая продукцию провоспалительных цитокинов (ФНО, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН, ИЛ-12), оксида азота NO, С-реактивного белка и молекул адгезии [27]. Показано, что НК-клетки конститутивно экспрессируют рецептор NOD2 и их стимуляция с помощью МДП приводит к усилению экспрессии рецепторов TLR2 и TLR5, продукции ИФН-γ и активации их функций [28]. Причем, что интересно, НК-клетки интернализируют МДП без участия белков-транспортеров, как это происходит, например, в макрофагах и эпителиальных клетках кишечника. При хроническом язвенном колите и болезни Крона в эпителии кишечника начинает продуцироваться транспортный белок hPepT1, с помощью которого осуществляется транспорт МДП в клетку [29]. Отсутствие этого механизма в НК-клетках приводит к прямой интернализации МДП и быстрому ответу на присутствие грам-позитивных и грам-негативных бактерий. Более того, для передачи сигнала от МДП к NOD2, локализованному во внутриклеточных везикулах, лизосомальное окисление не требуется, что также ускоряет ответ НК-клеток на МДП [28]. Однако в работе [28], показано, что культивирование чистой фракции НК-клеток в присутствии МДП приводит к незначительному увеличению уровня продукции ИФН-γ и количества клеток, экспрессирующих CD69 (в 1,52,7 раза по отношению к группе сравнения и при этом не у всех доноров: 5 из 15 образцов), а также незначительному увеличению цитотоксичности. Вместе с тем костимуляция в субоптимальной дозе ИФН-α или ИЛ-12 индуцирует высокий уровень продукции ИФН-γ и экспрессии CD69 НК-клетками.
Полученные нами данные об отсутствии стимулирующего влияния ГМДП-А на экспрессию генов ИФН-γ и его рецепторов НК-клетками здоровых доноров согласуются с приведенным выше исследованием. При этом следует отметить, что существуют данные о способности ГМДП нормализовать измененный уровень ИФН-γ. Так, в работе [30] показано, что у детей с выявленной предрасположенностью к бактериальным инфекциям и инфицированных вирусом Эпштейна-Барр, получавших иммунотропную терапию ликопидом (ГМДП) для предотвращения иммунологической дисфункции и негладкого течения периода реконвалесценции, отмечались достоверное снижение содержания атипичных мононуклеаров в крови (с 9,1 ± 1,2 до 1,0 ± 0,5%) и нормализация уровня ИФН-γ (снижение в 1,4 раза). С другой стороны, в работе [31] показано, что культивирование мононуклеарых клеток пациентов с атопической бронхиальной астмой в присутствии ГМДП приводит к значительному усилению секреции ИФН-γ (более чем в 3 раза при концентрации 5 мкг/мл - со 150 до 500 пг/мл), что свидетельствует о его влиянии на изменение баланса Th1/Th2 в сторону повышения активности Th1. При этом у здоровых доноров такой эффект ГМДП отсутствовал.
Анализ транскриптома НК-клеток, культивируемых в присутствии ГДМП-А, свидетельствует, что в клетках усиливается транскрипция генов, продукты которых участвуют в цитолитической активности НК-клеток (перфорин), а также влияют на функциональную активность этих клеток (рецепторы ИЛ-18) и на активацию других ИКК, что влечет за собой стимуляцию всех звеньев иммунной защиты. Эти данные, вероятно, свидетельствуют о том, что ГМДП-А стимулирует оба субтипа НК-клеток, поскольку продукцию перфорина и, соответственно, цитотоксическую активность НК-клеток осуществляет субтип CD56dimCD16+, а клетки с фенотипом CD56brightCD16- характеризуются преимущественно цитокин-продуцирующей функцией [4]. Увеличение уровня экспрессии гена рецептора ИЛ-18 свидетельствует о готовности НК-клеток к запуску каскада событий, связанных с активацией транскрипционных факторов NF-kB, рецептора ИЛ-2 и обусловленной им активации киназ STAT3 и STAT5, что в свою очередь индуцирует экспрессию генов и продукцию факторов, запускающих каскад событий, приводящий к формированию эффективного иммунного ответа на инфекционные и опухолевые антигены [18]. Вероятно, в ситуации in vivo или in vitro в присутствии широкого спектра ИКК и гуморальных факторов, в том числе ИЛ-18, продуцирующегося многими типами иммунных и неиммунных клеток, целесообразность увеличения экспрессии гена рецептора ИЛ-18 будет более очевидна. Эти данные свидетельствуют о том, что для реализации цитотоксической активности НК-клеток в ответ на присутствие МДП требуется участие других типов иммунных клеток, продуцирующих костимулирующие факторы.
В нашей модели клетки-мишени линии НТ-29 (аденокарцинома толстой кишки человека), чувствительной к НК-цитотоксичности, культивировали с клетками-эффекторами мононуклеарной фракции периферической крови здоровых доноров, в которой присутствуют, кроме НК-клеток, другие типы ИКК, которые, вероятно, и продуцируют костимулирующие цитокины (ИФН-а, ИЛ-12, ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-18 и др.) в ответ на присутствие ГМДП-А. В результате цитотоксическая активность НК-клеток в отношении клеток-мишеней НТ-29 возрастала в присутствии ГМДП-А (5 мкг/мл) при соотношении клеток мишень/эффектор 1:10 и в 3 раза превышала соответствующий показатель в группе сравнения (с 19,2 ± 1,5 до 57,1 ± 4,7), что свидетельствует об эффективности ГМДП-А в отношении стимуляции функциональной активности и НК-клеток, и клеток-продуцентов костимуляторов.
Таким образом, проведенное исследование свидетельствует о том, что ГМДП-А в дальнейшем можно рассматривать как кандидат для адъювантной неспецифической иммунотерапии злокачественных новообразований, поскольку в наших экспериментах этот агент позитивно влиял на функции НК-клеток, в частности активировал цитотоксическую активность, стимулируя экспрессию гена перфорина, а также был эффективен в отношении цитокин-продуцирующей способности НК-клеток, увеличивая уровень экспрессии рецептора ИЛ-18.