Особенности иммунного микроокружения в плаценте и гравидарном эндометрии у мышей со спонтанными, индуцированными и потенцированными абортами

• Артемьева Ксения Александровна
• Богданова Ирина Марковна
• Степанова Ирина Ильдаровна
• Болтовская Марина Николаевна
• Калюжин Олег Витальевич
• Степанов Александр Алексеевич
• Земляков Александр Евгеньевич

Резюме

Невынашивание беременности остается актуальной медико-социальной проблемой во всем мире. Фетально-материнское взаимодействие, в котором большое значение играют про- и противовоспалительные цитокины, определяет исход беременности. Целью исследования была сравнительная оценка иммунного микроокружения в плаценте и гравидарном эндометрии на различных мышиных моделях беременности. При моделировании физиологической беременности использовали комбинацию мышей ♀CBA×♂BALB/c. Спонтанные аборты воспроизводили при скрещивании ♀CBA×♂DBA/2. Индуцированные или потенцированные иммуностимулятором аборты моделировали соответственно в комбинациях ♀CBA×♂BALB/c или ♀CBA×♂DBA/2 внутрибрюшинным введением β-гептилгликозида мурамилдипептида на 5-й и 7-й дни гестации. Мышей выводили из эксперимента на 8-й день гестации и выделяли маточно-плацентарные единицы. В фиксированных формалином срезах маточно-плацентарных единиц, залитых парафином, иммуногистохимически окрашивали клетки, продуцирующие трансформирующий ростовой фактор-β (ТФРβ) и интерлейкин-10 (ИЛ-10), с последующей оценкой плотности их распределения. В супернатантах гомогенатов маточно-плацентарных единиц определяли концентрацию цитокинов ИЛ-1α, ИЛ-5, ИЛ-10, интерферона-γ (ИФН-γ). На модели спонтанных абортов плотность ТФРβ- и ИЛ-10-продуцирующих клеток в гравидарном эндометрии была существенно ниже, чем у мышей с физиологической беременностью. В условиях индуцированных абортов количество этих клеток не отличалось от такового при физиологической беременности, а на модели потенцированных абортов была снижена плотность распределения только ИЛ-10⁺-клеток. В гомогенатах маточно-плацентарных единиц мышей отмечался низкий уровень ИЛ-1а в группах спонтанных и потенцированных абортов. В группе индуцированных абортов наблюдали наибольший уровень ИЛ-5 в сравнении с группами физиологической беременности и потенцированных абортов. Уровень ИЛ-10 был наибольшим в группе физиологической беременности, а в группе спонтанных абортов - наименьшим, что соответствовало показателям плотности ИЛ-10⁺-клеток, полученных в результате анализа иммуногистохимического окрашивания. Уровень ИФН-γ был наибольшим в группе физиологической беременности и наименьшим в группе спонтанных абортов. В группе потенцированных абортов его уровень увеличился по сравнению с группой спонтанных абортов. Усиление резорбции в группе индуцированных абортов происходит на фоне снижения уровня ИЛ-10 и повышения уровня ИЛ-5, а в группе потенцированных абортов - на фоне повышения уровней как ИЛ-10, так и ИФН-γ. Очевидно, что абортогенное действие С7МДП у беременных мышей с исходно различным уровнем эмбриональных потерь реализуется с участием различных иммунных механизмов.

Ключевые слова:иммунная толерантность; цитокины; мурамилдипептид; невынашивание беременности

Введение

Частота невынашивания беременности варьирует от 12 до 27% всех клинически установленных беременностей и не имеет тенденции к снижению [1]. Более чем в 30% случаев потери беременности обусловлены нарушениями иммунной толерантности матери к фетоплацентарной единице [2]. При этом механизмы, с помощью которых иммунные расстройства вызывают самопроизвольный аборт, остаются до конца не изученными. Гестация сопровождается сложными по динамике и последовательности, строго регулируемыми иммунными реакциями, направленными на поддержание полуаллогенной беременности путем создания толерогенного микроокружения для тканей плода, экспрессирующего чужеродные отцовские антигены. Иммунологическая связь между матерью и развивающимся в ней зародышем в отсутствие прямого контакта формируется благодаря взаимодействию материнского и фетального компонентов плаценты, а именно децидуальной оболочки и трофобласта соответственно. Толерантность иммунной системы матери к фетальным антигенам осуществляется в присутствии большого числа материнских лейкоцитов.

Иммуномодулирующие молекулы, экспрессируемые и секретируемые клетками децидуа и плаценты, могут быть прямо вовлечены в супрессию локальных воспалительных реакций. Интерлейкин-10 (ИЛ-10) считается одним из важнейших медиаторов успешной беременности у человека и мыши. Он играет ключевую роль в поддержании иммунной толерантности, главным образом через снижение уровня провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12 и фактор некроза опухоли а (ФНОα), и блокаду экспрессии молекул II класса главного комплекса гистосовместимости и костимуляторных молекул CD80/CD86 [3]. ИЛ-10 продуцируют клетки адаптивного иммунитета, включая регуляторные Т-клетки (Treg) и некоторые субпопуляции CD8⁺-Т-лимфоцитов, а также клетки врожденного иммунитета - моноциты, макрофаги, дендритные клетки, гранулоциты, нейтрофилы, эозинофилы и тучные клетки [4, 5]. Выработка ИЛ-10 контролируется и программируется в маточно-плацентарной зоне (МПЗ) на различных стадиях нормальной беременности. У мышей ИЛ-10 экспрессируется в течение всей гестации с пиком на 12-й день. Нарушения продукции ИЛ-10 ассоциированы с невынашиванием и осложнениями беременности, такими как преждевременные роды, задержка роста плода и преэклампсия. На моделях in vivo показано, что введение рекомбинантного ИЛ-10 полностью или частично купирует симптомы, характерные для неблагоприятных исходов беременности [6].

Трансформирующий ростовой фактор в (ТФРβ) - еще один ключевой медиатор иммуносупрессии, индуцируемой Treg, которые могут непосредственно секретировать растворимые супрессорные факторы или индуцировать их выработку другими, в том числе антиген-представляющими, клетками [7]. CD4⁺CD25⁺-Treg играют важную роль в поддержании фетальной толерантности в период имплантации и в ранней фазе беременности, но их участие не является необходимым в поздние сроки аллогенной беременности у мышей [8, 9]. ТФРβ поляризует дифференцировку наивных CD4⁺CD25^--T-клеток после антигенной стимуляции в CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺-Treg [10].

Основным постулатом современных представлений о роли иммунной системы во время беременности является активное фетально-материнское взаимодействие, в котором ведущую роль играют про- и противовоспалительные цитокины [11-14]. Так, ИЛ-10 рассматривается как ключевой цитокин ранней беременности, поскольку участвует в ряде важнейших событий, таких как формирование плаценты [15], плацентарный ангиогенез, регуляция трофобластической инвазии, а также защищает фетоплацентарную единицу путем подавления синтеза и секреции провоспалительных цитокинов, включая ИЛ-6, ФНОα, интерферон у (ИФН-γ). ИЛ-10 также может участвовать в М2-поляризации через активацию сигнального пути JAK-STAT при связывании с ИЛ-10 специфическим рецепторным комплексом [16]. Влияние ИЛ-5 на рост и функции плаценты и массу потомства определяется генотипом самца. Так, у потомства ИЛ-5-нокаутных самок отмечали небольшое увеличение массы тела, более выраженное у F1 C57B1/6 и CBA [17]. ИЛ-1α повышает экспрессию металлопротеиназы ММР-3, необходимой для ремоделирования стромы, в периимплантационном периоде, обеспечивая прогрессирование беременности [18]. С другой стороны, повышение уровня ИЛ-1α может быть одной из причин потери беременности [19]. ИФН-γ играет важную физиологическую роль в структурно-функциональной гестационной перестройке стромы и сосудов эндометрия, регуляции активности трофобласта [20]. В то же время ряд клинических и экспериментальных данных свидетельствуют о том, что избыток ИФН-γ связан с осложнениями беременности вплоть до гибели плода у человека и животных [21].

Мышь, обладая сходным с человеком типом маточно-плацентарной области и плаценты, а также близкой к человеку структурой материнского и плодного кровообращения [22], широко используется для моделирования невынашивания. Самки мышей CBA/J, спаривающиеся с самцами DBA/2, подвержены спонтанному прерыванию беременности вследствие многочисленных иммунных нарушений и часто используются при моделировании спонтанных абортов [23]. Ранее нами были разработаны модели индуцированных и потенцированных абортов, вызванных введением β-гептилгликозида мурамилдипептида (С7МДП) мышам с исходно физиологической беременностью или спонтанными абортами соответственно [24]. С7МДП является синтетическим производным мурамилдипептида (МДП) - природного иммуноактивного компонента пептидогликана клеточной стенки бактерий [25, 26]. Связываясь с рецептором NOD2, МДП и его производные запускают NF-кВ-сигнальный путь [27, 28] и стимулируют продукцию провоспалительных цитокинов Th1-клетками и макрофагами [29, 30].

На моделях in vivo установлено, что МДП усиливает гуморальный и клеточный иммунный ответ, регулирует баланс Тh1/Th2 [31, 32, 33]. Особый интерес для иммунологии репродукции представляет присутствие NOD2-рецепторов в цитотрофобласте и синцитиотро-фобласте в I триместре беременности человека [34]. Клетки трофобласта in vitro отвечают на экспозицию с МДП продукцией провоспалительных цитокинов. Реакция является специфичной, поскольку NOD2-дефицитные линии клеток трофобласта не отвечают на МДП [35].

Цель работы - сравнительная оценка иммунного микроокружения в плаценте и гравидарном эндометрии у мышей при спонтанных, индуцированных и потенцированных абортах.

Материал и методы

Экспериментальные животные

Исследование проводили на 8-10-недельных мышах инбредных линий CBA, DBA/2, Balb/c массой тела 23-25 г, полученных из филиала "Столбовая" Научного центра биомедицинских технологий ФМБА России. Эксперименты осуществляли в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных, утвержденными приказом Минздрава СССР № 755 от 12 августа 1977 г. На проведение эксперимента получено разрешение биоэтической комиссии НИИ морфологии человека (протокол № 6А от 19 октября 2009 г.)

Моделирование физиологической и патологической беременности у мышей

С целью получения датированной беременности самок в стадии проэструс-эструс подсаживали на ночь к самцам в отношении 3-4:1. День появления копулятивной пробки обозначали как 1-й день гестации (ДГ).

Для моделирования аллогенной физиологической беременности использовали комбинацию линий мышей ♀CBA×♂ Balb/c, высокий уровень спонтанных абортов воспроизводили при скрещивании самок CBA с самцами DBA/2 [36]. Для моделирования индуцированных и потенцированных абортов группам мышей с исходно нормальной беременностью или спонтанными абортами соответственно на 5-й ДГ (завершение имплантации) и 7-й ДГ (до начала формирования плаценты) внутрибрюшинно в 0,1 мл 0,9% раствора NaCl вводили С7МДП в дозе 20 мкг на 1 животное (≈1 мг/кг). С7МДП синтезирован по методу [37] и предоставлен для моделирования иммунозависимых абортов кафедрой органической химии ФГАОУ ВО Крымского федерального университета имени В.И. Вернадского, г. Симферополь. Выбранная доза С7МДП соответствовала ED₅₀, определенной в серии экспериментов на моделях сепсиса in vivo [29]. Мышей выводили из эксперимента путем цервикальной дислокации под эфирным наркозом на 8-й ДГ (начало формирования плаценты). Частоту резорбции оценивали по формуле

где R - доля резорбированных эмбрионов/плодов по отношению к общему числу плодов, Re - количество резорбированных эмбрионов, F - количество жизнеспособных эмбрионов [38].

Для проведения исследования были сформированы 4 экспериментальные группы животных по 6 особей в каждой:

1) самки с физиологической беременностью;

2) самки со спонтанными абортами;

3) самки с индуцированными абортами;

4) самки с потенцированными абортами.

Иммуногистохимическое окрашивание

После выведения животных из эксперимента осуществляли забор маточно-плацентарных единиц. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Кусочки тканей проводили по спиртам восходящей крепости (70°, 80°, 96°, 100°), заливали в парафин, изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм. В фиксированных формалином срезах препаратов маточно-плацентарных единиц, залитых парафином, были специфически окрашеныклетки, продуцирующие ТФР-β и ИЛ-10, кроличьими поликлональными анти-ТФРβ (1:100, ab 66043, Abcam, Cambridge, Великобритания) козьими поликлональными анти-ИЛ-10 (sc-1783, 1: 100, Santa Cruz Biotechnology, Texas, США) соответственно. В качестве вторичных антител были использованы кроличьи поликлональные антитела к IgG козы, меченные пероксидазой хрена (ab 6741, Abcam, Cambridge, UK), а также набор для проявления LabVision™ UltraVision™ LP Detection System: HRPPolymer/DABPlus Chromogen (TL-015-HD), ThermoScientific™, Cheshire, Великобритания). По окончании инкубации с антителами срезы докрашивали гематоксилином Майера.

Выделение маточно-плацентарных тканей для определения продукции цитокинов ex vivo

Маточно-плацентарные единицы каждой мыши измельчали ножницами и в гомогенизаторе Поттера в растворе Хенкса, рН 7,2 (ПанЭко, Россия), с добавлением 1 таблетки смеси ингибиторов протеаз / 10 мл Complete Mini protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics, Indianapolis, Indianapolis, США): 50 мг ткани в 0,5 мл раствора. После этого их центрифугировали при 12000 об/мин в течение 3 минут. Супернатанты собирали в объеме 0,3 мл и измеряли концентрацию белка по Лоури. Затем их хранили при -80°С до использования для анализа.

Проточная цитофлюориметрия

Концентрацию цитокинов ИЛ-1α, -5, -10, ИФН-γ определяли в супернатантах гомогенатов маточно-плацентарных единиц, выделенных на 8-й ДГ с использованием набора Mouse TX1/TX2 10plex (Bender Med Systems, Австрия) на приборе Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, США). Концентрацию цитокинов вычисляли с помощью программы Flow Cytomix Pro (Beckman Coulter, США).

Морфометрические методы

Морфометрическое исследование проводили на микроскопе Leica DM 2500 с цифровой фотокамерой при помощи графического планшета и программы Image Scope M (Leica Microsystems GmbH, Германия). Подсчитывали плотность распределения ТФРβ- и и ИЛ-10⁺-клеток на 1 мм² площади гравидар-ного эндометрия в препаратах маточно-плацентарных единиц.

Статистическая обработка результатов

Данные анализировали с помощью программы Sigma Stat 3.5 (Systat Software, Inc.). Характер распределения анализируемых параметров в выборках оценивали с помощью критерия Колмогорова-Смирнова, для сравнения двух выборок использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Для сравнения долей применяли z-критерий с коррекцией Йейтса. Результаты представляли в виде медианы и квартилей. Различия считали значимыми при p < 0,05.

Результаты

В настоящей работе на 8-й ДГ частота резорбции в группе физиологической беременности составляла 12,5%, спонтанных абортов - 34,8%, группах индуцированных и потенцированных абортов - 46,7 и 50,0% соответственно (табл. 1). Развивающуюся беременность характеризовало наличие полноценного эмбриона и всех его мембран. Эктоплацентарный конус (ЭПК) имел характерную заостренную форму. Четко визуализировались гигантские клетки трофобласта, расположенные по периметру эмбриональной полости. Резорбцией считали как полное исчезновение эмбриона и его мембран, так и отдельные изменения: задержку роста, значительные нарушения строения ЭПК, в т. ч. уплощение или полное его исчезновение. Наблюдали расширение сосудов в зоне мезометриальной decidua (вплоть до формирования гигантских полостей) и застой крови в них, а также конденсацию трофобласта и геморрагии в decidua basalis.

В результате проведенного исследования выявили следующие изменения в маточно-плацентарной области (табл. 2). Медиана плотности клеток, продуцирующих ТФРβ, была наибольшей в группе индуцированных абортов и наименьшей - в группе спонтанных абортов. Медиана плотности клеток, продуцирующих ИЛ-10, в группе физиологической беременности была наибольшей, а в группе спонтанных абортов - наименьшей.

В сравнении с группой физиологической беременности группа спонтанных абортов изначально отличалась низким уровнем ТФРβ- и ИЛ-10-продуцирующих клеток. Вероятно, это является одной из причин высокого уровня резорбции эмбрионов в этой группе. Группу потенцированных абортов отличала большая плотность ТФРβ⁺- и ИЛ-10⁺- клеток по сравнению с группой спонтанных абортов, но меньшая - по сравнению с группой индуцированных абортов.

Измеряли концентрацию цитокинов ИЛ-1α, ИЛ-5, ИЛ-10, и ИФН-γ в гомогенатах маточно-плацентарных единиц (табл. 3). В сравнении с группой физиологической беременности отмечалось снижение уровня ИЛ-1α в группах спонтанных и потенцированных абортов, а в группе потенцированных абортов - по сравнению с группой индуцированных. В группе индуцированных абортов наблюдали наибольший уровень ИЛ-5 в сравнении с группами физиологической беременности и потенцированных абортов. Уровень ИЛ-10 был наибольшим в группе физиологической беременности, достоверно отличаясь от уровня этого цитокина в группах спонтанных и индуцированных абортов, а в группе спонтанных абортов - наименьшим, что соответствовало показателям плотности ИЛ-10⁺-клеток, полученных в результате анализа иммуногистохимического окрашивания. Отмечалось снижение уровня ИЛ-10 в группе индуцированных абортов по сравнению с группой физиологической беременности, но повышение его в группе потенцированных абортов в сравнении с группой спонтанных абортов. Уровень ИФН-γ был наибольшим в группе физиологической беременности и наименьшим в группе спонтанных абортов. В группе потенцированных абортов его уровень увеличился по сравнению с группой спонтанных абортов.

Обсуждение

Полученные результаты определения частоты резорбции на 8-й ДГ были сопоставимы как с результатами других авторов (7-13% и 11-41% резорбированных эмбрионов при моделировании физиологической беременности и спонтанных абортов, соответственно) [39], так и с нашими результатами определения резорбции на 14-й ДГ [40]. Очевидно, в течение 24-72 ч после первого введения С7МДП происходили структурнофункциональные изменения плаценты и гибель эмбриона. В сравнении с группой физиологической беременности, группа спонтанных абортов изначально отличалась низким уровнем ТФРβ- и ИЛ-10-продуцирующих клеток. Вероятно, это является одной из причин высокого уровня резорбции эмбрионов в этой группе. Потенцированные аборты отличала большая плотность ТФРβ⁺- и ИЛ-10⁺-клеток по сравнению со спонтанными, но меньшая - по сравнению с индуцированными абортами. Очевидно, это связано со способностью С7МДП усиливать гуморальный и клеточный иммунный ответ, а также регулировать баланс Th1/Th2. Линейными различиями объясняется, вероятно, тот факт, что в группе индуцированных абортов не наблюдалось статистически значимых изменений в плотности распределения ТФРβ- и ИЛ-10-продуцирующих клеток в сравнении с физиологической беременностью. Увеличение количества этих клеток, в свою очередь, не отменяло абортогенный эффект других факторов, определяющих высокий уровень резорбции в группе потенцированных абортов, и не запускало компенсаторный механизм, направленный на отмену резорбции. Примечательно, что минимальные значения уровней цитокинов характерны для группы спонтанных абортов. Исследование культивируемых клеток трофобласта мыши, полученных из ЭПК, показало, что ИФН-γ усиливает фагоцитарную активность клеток трофобласта как механизм снабжения плода железом и питательными веществами до начала формирования и функционирования плаценты [41]. Таким образом, как избыток, так и недостаток этого цитокина может оказывать неблагоприятное воздействие на развивающийся эмбрион. Дефицит плацентарной и децидуальной продукции ИЛ-10 ассоциирован с внутриутробной задержкой роста плода у женщин и лабораторных мышей, а также характерен для беременности с высокой частотой спонтанных абортов [42, 43]. Несмотря на однотипное воздействие С7МДП на беременных самок, усиление резорбции в группе индуцированных абортов происходит на фоне снижения уровня ИЛ-10 и повышения уровня ИЛ-5, а в группе потенцированных абортов - на фоне повышения уровней как ИЛ-10, так и ИФН-γ. Подобное различие можно объяснить как индивидуально-групповыми различиями в реактивности животных, так и плейотропным эффектом данного вещества. Очевидно, абортогенное действие С7МДП у беременных мышей с исходно различным уровнем эмбриональных потерь реализуется с участием различных иммунных механизмов. Таким образом, в работе впервые исследованы особенности экспрессии цитокинов ТФРβ, ИЛ-1α, ИЛ-5, ИЛ-10 и ИФН-γ, участвующих, по данным литературных источников, в создании толерогенного микроокружения маточно-плацентарной единицы и защищающих эмбрион от иммунной атаки со стороны матери, на моделях индуцированного и потенцированного невынашивания беременности у мышей.

Литература

1. Внутриутробное развитие человека. Руководство для врачей. Под редакцией проф. А.П. Милованова, проф. С.В. Савельева. М. : МДВ. 2006.

2. Сидельникова В.М., Сухих Г.Т. Невынашивание беременности: Руководство для практикующих врачей М. : МИА. 2011.

3. Robertson S.A., Care A.S., Skinner R.J. Interkeukin 10 regulates inflammatory cytokine synthesis to protect against lipopolysac-charide-induced abortion and fetal growth restriction in mice. Biol. Reprod. 2007; 76 (5): 738-748. doi: 10.1095/biolreprod.106.056143

4. Saraiva M., O’Garra A. The regulation of IL-10 production by immune cells // Nat. Rev. Immunol. 2010; 10 (3): 170-181. doi: 10.1038/nri2711

5. ^eng S.B., Sharma S. Interleukin-10: a pleiotropic regulator in pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 2015; 73 (6): 487-500. doi: 10.1111/aji.12329

6. Lai Z., Kalkunte S., Sharma S. A critical role of interleukin-10 in modulating hypoxia-induced preeclampsia-like disease in mice. Hypertension. 2011; 57 (3): 505-514. doi: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.110.163329

7. Sojka D.K., Huang Y.H., Fowell D.J. Mechanisms of regulatory T-cell suppression - a diverse arsenal for a moving target. Immunology. 2008; 124 (1): 13-22. doi: 10.1111/j.1365-2567.2008.02813.x

8. Aluvihare V.R., Kallikourdis M., Betz A.G. Tolerance, suppression and the fetal allograft. J. Mol. Med. (Berl). 2005; 83 (2): 88-96. doi: 10.1007/s00109-004-0608-2

9. Shima T., SasakiY., Itoh M., NakashimaA., Ishii N., Sugamura K. et al. Regulatore T cells are necessary for implantation and maintenance of early pregnancy but not late pregnancy in allogeneic mice. J. Reprod. Immunol. 2010; 85 (2): 121-129. doi: 10.1016/j.jri.2010.02.006

10. Chen W., Jin W., Hardegen N., Lei K.J., Li L., Marinos N. et al. Conversion of peripheral CD4+CD25^- naive T cells to CD4+CD25+ regulatory T cells by TGF-beta induction of transcription factor Foxp3. J. Exp. Med. 2003; 198 (12): 1875-1886. doi: 10.1084/jem.20030152

11. Kwak-Kim J., Park J.C., Ahn H.K., Kim J.W., Gilman-Sachs A. Immunological modes of pregnancy loss. Am. J. Reprod. Immunol. 2010; 63 (6): 611-623. doi: 10.1111/j.1600-0897.2010.00847.x

12. Saito S., Nakashima A., Shima T., Ito M. Th1/Th2/Th17 and regulatory T-cell paradigm in pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 2010; 63 (6): 601-610. doi: 10.1111/j.1600-0897.2010.00852.x

13. Mor G., Cardenas I. The Immune System in Pregnancy: A Unique Complexity. Am. J. Reprod. Immunol. 2010; 63 (6): 425433. doi: 10.1111/j.1600-0897.2010.00836.x

14. Chen S.J., Liu Y.L., Sytwu H.K. Immunologic Regulation in Pregnancy: From Mechanism to Therapeutic Strategy for Immu-nomodulation. Clin. Dev. Immunol. 2012; 258-391. doi: 10.1155/2012/258391

15. Thaxton J.E., Sharma S. Interleukin-10: a multi-faceted agent of pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 2010; 63 (6): 482-491. doi: 10. 10.1111/j.1600-0897.2010.00810.x

16. Porta C., Riboldi E., Ippolito A., Sica A. Molecular and epigenetic basis of macrophage polarized activation. Semin. Immunol. 2015; 27 (4): 237-248. doi: 10.1016/j.smim.2015.10.003

17. Ingman W.V., Jones R.L. Cytokine knockouts in reproduction: the use of gene ablation to dissect roles of cytokines in reproductive biology. Hum. Reprod. Update. 2008; 14 (2): 179-192. doi:10.1093/humupd/dmm042

18. Nishiura R., Noda N., Minoura H., Toyoda N., Imanaka-Yo-shida K., Sakakura T., Yoshida T. Expression of matrix metalloproteinase-3 in mouse endometrial stromal cells during early pregnancy: regulation by interleukin-1alpha and tenascin-C. Gynecol. Endocrinol. 2005; 21 (2): 111-118. doi: 10.1080/09513590500168399

19. Deb K., Chaturvedi M.M., Jaiswal Y.K. A ‘minimum dose’ of lipopolysaccharide required for implantation failure: assessment of its effect on the maternal reproductive organs and interleukin-1alpha expression in the mouse. Reproduction. 2004; 128 (1): 87-97. doi: 10.1530/rep.1.00110

20. Kitaya K., Yasuo T., Yamaguchi T., Fushiki S., Honjo H. Genes regulated by interferon-gamma in human uterine microvascular endothelial cells. Int. J. Mol. Med. 2007; 20 (5): 689-697.

21. Murphy S.P, Tayade C., Ashkar A.A., Hatta K., Zhang J., Croy B.A. Interferon Gamma in Successful Pregnancies. Biol. Reprod. 2009; 80 (5): 848-859. doi: 10.1095/biolreprod.108.073353

22. Carter A.M. Animal models of human placentation. Placenta. 2007; 21 (A): 41-47.

23. Kwak-Kim J., Bao S., Lee S.K., Kim J.W., Gilman-Sachs A. Immunological modes of pregnancy loss: inflammation, immune effectors, and stress. Am. J. Reprod. Immunol. 2014; 72 (2): 129-140. doi: 10.1111/aji.12234

24. Артемьева К.А., Болтовская М.Н., Калюжин О.В. Моделирование индуцированного невынашивания беременности на мышах с использованием гликозида мурамилдипептида. Курский научнопрактическийвестник"Человек и его здоровье". 2012; 2: 34-39.

25. Hedl M., Abraham C. Distinct roles for Nod2 protein and autocrine interleukin-1beta in muramyl dipeptide-induced mitogen-activated protein kinase activation and cytokine secretion in human macrophages. J. Biol. Chem. 2011; 286 (30): 26440-26449. doi: 10.1074/jbc.M111.237495

26. Kusumoto S., Fukase K., Shiba T. Key structures of bacterial peptidoglycan and lipopolysaccharide triggering the innate immune system of higher animals: Chemical synthesis and functional studies. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 2010; 86 (4): 322-337.

27. Inohara N., Ogura Y., Fontalba A., Gutierrez O., Pons F., Crespo J. et al. Host recognition of bacterial muramyl dipeptide mediated through NOD2. Implications for Crohn’s disease. J. Biol. Chem. 2003; 278 (8): 5509-5512. doi: 10.1074/jbc.C200673200

28. Athie-Morales V, O’Connor G.M., Gardiner C.M. Activation of Human NK Cells by the Bacterial Pathogen-Associated Molecular Pattern Muramyl Dipeptide. The Journal of Immunology. 2008; 180 (6): 4082-4089. doi: 10.4049/jimmunol.180.6.4082

29. Калюжин О.В., Калина Н.Г., Баштаненко А.Ф., Шка-левМ.В., Кузовлев Ф.Н., Калюжин В.В. Стимуляциярезистентности мышей к бактериальнойинфекциигликозидами мурамилдипептида. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2003; 135 (5): 531-535.

30. Калюжин О.В., Земляков А.Е., Калина Н.Г., Мулик Е.Л., Кузовлев Ф.Н. Макарова О.В. Биологическая активность аномер-ных пар липофильных гликозидов N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2008; 145 (5): 561-564.

31. Hirota S.A., Ng J., Lueng A., Khajah M., Parhar K., Li Y. et al. NLRP3 inflammasome plays a key role in the regulation of intestinal homeostasis. Inflamm. Bowel. Dis. 2011; 17 (6): 1359-1372. doi: 10.1002/ibd.21478

32. Matsui K., Ikeda R. Peptidoglycan in combination with mu-ramyldipeptide synergistically induces an interleukin-10-dependent T helper 2-dominant immune response. Microbiol Immunol. 2014; 58 (4): 260-265. doi: 10.1111/1348-0421.12139

33. Kotani S., Tsujimoto M., Koga T., Nagao S., Tanaka A., Kawata S. Chemical structure and biological activity relationship of bacterial cell walls and muramyl peptides. Federat. Proc. 1986; 45 (11): 2534-2540.

34. Abrahams V.M. The role of the Nod-like receptor family in tro-phoblast innate immune responses. J. Reprod. Immunol. 2011; 88 (2): 112-117. doi: 10.1016/j.jri.2010.12.003

35. Costello M.J., Joyce S.K., Abrahams V.M. NOD protein expression and function in first trimester trophoblast cells. Am. J. Reprod. Immunol. 2007; 57 (1): 67-80. doi: 10.1111/j.1600-0897.2006.00447.x

36. Clark D.A., Chaouat G., Banwatt D., Friebe A., Arck P.C. Ecology of danger-dependent cytokine-boosted spontaneous abortion in the CBA x DBA/2 mouse model: II. Fecal LPS levels in colonies with different basal abortion rates. Am. J. Reprod. Immunol. 2008; 60 (6): 529-933. doi: 10.1111/j.1600-0897.2008.00652.x

37. Земляков А.Е., Цикалов В.В., Калюжин О.В. Синтез и исследование влияния конфигурации гликозидной связи и природы агликона на иммуностимулирующую активность гликозидов му-рамоилдипептида. Физиологически активныевещества. 2002; (1): 35-38.

38. Du M.R., Dong L., Zhou W.H. Yan F.T., Li D.J. Cyclosporin A improves pregnancy outcome by promoting functions of trophoblasts and inducing maternal tolerance to the allogeneic fetus in abortion-prone matings in the mouse. Biol. Reprod. 2007; 76 (5): 906-914. doi: 10.1095/biolreprod.106.056648

39. Chaouat G., Menu E., Clark D.A., Dy M., Minkowski M., Wegmann T.G. Control of fetal survival in CBA x DBA/2 mice by lymphokine therapy. J. Reprod. Fertil. 1990; 89 (2): 447-458.

40. Артемьева К.А., Болтовская М.Н., Калюжин О.В. Моделирование индуцированного невынашивания беременности на мышах с использованием гликозида мурамилдипептида. Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье". 2012; (2): 34-39.

41. Albieri A., Hoshida M.S., Gagioti S.M., Leanza E.C., Abraha-msohn I., Croy A. et al. Interferon-gamma alters the phagocytic activity of the mouse trophoblast. Reprod. Biol. Endocrinol. 2005; (3): 34. doi: 10.1186/1477-7827-3-34

42. Moreli J.B., Ruocco A.M.C., Vernini J.M., Rudge M.V.C., Calderon I.M.P. Interleukin 10 and Tumor Necrosis Factor-Alpha in Pregnancy: Aspects of Interest in Clinical Obstetrics ISRN. Obstet. Gynecol. 2012; 2012: 230742. doi: 10.5402/2012/230742

43. Zenclussen M.L., Thuere C., Ahmad N., Wafula P.O., Fest S., Teles A. et al. The persistence of paternal antigens in the maternal body is involved in regulatory T-cell expansion and fetal-maternal tolerance in murine pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 2010; 63 (3): 2002008. doi: 10.1111/j.1600-0897.2009.00793.x