Влияние мурамилпептида на микробный состав микрофлоры ротовой полости

• Гурьянова Светлана Владимировна
• Борисова О.Ю.
• Колесникова Н.В.
• Лежава Нино Леонидовна
• Козлов Иван Генрихович
• Гудима Георгий Олегович

Резюме

Введение. Состав микробиоты полости рта имеет определяющее значение в формировании нормального микробиоценоза, а его дисбаланс может быть причиной патофизиологических процессов не только полости рта, но и всего организма. Нарушение разнообразия микрофлоры ротовой полости, уменьшение в количественном отношении представленности условно-патогенной микрофлоры способствуют заселению патогенными штаммами и коррелируют с различными заболеваниями ротовой полости, такими, как кариес и пародонтиты, заболеваниями желудочно-кишечного тракта и бронхолегочной системы.

Цель исследования - определить влияние мурамилпептида ГМДП (Ликопид^® 1 мг) на микробный пейзаж ротовой полости здоровых добровольцев.

Материал и методы. При информированном согласии у 48 здоровых добровольцев 18-23 лет проводили забор ротовой жидкости до приема ГМДП (профилактический прием, Ликопид^® 1 мг) и через 4 дня после 10-дневного курса 1 таблетка сублингвально 1 раз в день. Микробиологическое исследование ротовой жидкости выполняли с помощью газовой хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров.

Результаты. Иммуномодулирующее средство на основе мурамилпептида способствует увеличению разнообразия микрофлоры ротовой полости, уменьшению в количественном выражении Candida albicans, Clostridium difficile и Porphyromonas gingivalis.

Заключение. Применение иммуномодулирующего средства на основе мурамилпептида целесообразно для формирования нормального сбалансированного микробиоценоза с целью предотвращения заселения патогенами.

Ключевые слова:микробиота; ротовая полость; мурамилпептид; ГМДП; биоценоз; иммуномодуляторы; мукозальный иммунитет

Введение

Микроорганизмы, населяющие кожные покровы и слизистые человека, являются необходимым условием поддержания гомеостаза, и принимают участие во всех процессах жизнедеятельности организма человека с момента рождения [1-4]. В стерильных условиях в экспериментальной модели животные не способны сформировать адекватную систему защиты от патогенов [5], нарушаются процессы метаболизма, приводящие к ожирению [6, 7], онкологическим заболеваниям [8, 9], формированию фенотипа аутизма [10].

Установление определяющего значения микроорганизмов в формировании и поддержании гомеостаза человека послужило основанием для формирования понятия "суперорганизм" [11, 12], учитывая эволюционно сформировавшиеся связи между макроорганизмом и населяющими его микроорганизмами; геном микробиоты рассматривается как третий основной геном у человека наряду с ядерным и митохондриальным [13] и превышает по объему геном хозяина в 10 раз [14].

Предпринимаются усилия для выяснения сложности композиции микроорганизмов, составляющих уникальную экосистему желудочно-кишечного тракта, его слизистых, эпидермиса, исследуются механизмы регуляции микроорганизмами нормобиоценоза, их участия в инфекционном процессе, выраженности клинических проявлений, исходе заболевания: излечении или хронизации [15]. Особое внимание уделяется микробному составу ротоглотки как прогностическому маркеру стоматологического статуса и ЛОР-патологии [16, 17].

Анализ микробиома полости рта здоровых людей с использованием последних достижений в технологии секвенирования выявил, что большая часть видов бактериальных микроорганизмов у здоровых людей, не состоящих в родстве, идентична [18]. Показано, что наличие микробных ассоциаций и разнообразный состав микрофлоры биотопов полости рта свидетельствуют о нормоценозе и являются благоприятным прогностическим фактором излечения [19, 20]. В то же время охарактеризованы микроорганизмы и их ассоциации, оказывающие патологическое действие на слизистую ротовой полости, пародонт и ткани зуба. В полости рта выделяют три основных сообщества: а) микроорганизмы, населяющие слизистую оболочка щеки, ороговевшую десну и твердое нёбо; б) микроорганизмы, населяющие суб- и супрагингивальные бляшки; в) микроорганизмы, находящиеся в слюне и на языке [21]. Слюна является наиболее удобным объектом изучения и широко используется в клинических исследованиях для выявления корреляции между составом микробиоценоза и развитием местного или системного патофизиологического процесса, в том числе инфекционной природы.

В данном исследовании ставились задачи изучения разнообразия микрофлоры, представленной в ротовой полости, и выявления возможности регуляции микробиоценоза с помощью низкомолекулярных биорегуляторов бактериального происхождения. К числу наиболее изученных низкомолекулярных компонентов бактериальной природы относятся мурамилпептиды. Они представляют собой фрагменты пептидогликана бактерий и реализуют свою активность через NOD2-рецепторы врожденного иммунитета, запуская провоспалительный ответ организма [22]. По современным представлениям NOD2-рецептор является основным рецептором врожденного иммунитета, регулируя активность реакций не только врожденного, но и адаптивного иммунитета [23]. Активация NOD2-рецептора приводит к продукции ИЛ-1, ИЛ-6, интерферона-γ, а также дефензинов и кателицидинов - основных факторов противоинфекционного процесса [24]. Показано также влияние мурамилпептидов на представителей микробного сообщества: аналог глюкозаминилмура-милдипептида (ГМДП) способствует индукции факторов Rfps у Micobacterium tuberculosis, ответственных за выход бактерии из дормантной формы, обеспечивая эффективность химиотерапии туберкулеза [25], что является теоретическим обоснованием полученных ранее на практике результатов эффективного лечения туберкулеза ликопидом в составе комплексной терапии [26].

Материал и методы

Участники исследования. В исследовании принимали участие 48 здоровых добровольцев в возрасте 18-23 лет: 28 женщин и 20 мужчин. Исследование проходило в Медицинском центре РУДН. У всех участников исследования получено информированное согласие на участие в исследовании согласно Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации и обработку персональных данных [27]. Критерием включения стало отсутствие заболеваний полости рта, в том числе кариеса и пародонтита, и ЛОР-органов; все пациенты не употребляли антибиотики в последние 2 мес до проведения исследования и во время эксперимента, не курили, не употребляли продукты, содержащие алкоголь. Материалом для исследования служила ротовая жидкость. 1 мл слюны забирали стерильным шприцем из подъязычной области в стерильные пробирки до применения ГМДП (препарат Ликопид® 1 мг, АО "Пептек", Москва, Россия) и через 4 дня после 10-дневного курса препарата. Препарат применяли согласно инструкции сублингвально 1 раз в день за 30 мин до еды в течение 10 дней.

Анализ микробиологического состава ротовой жидкости проводили с помощью стандартного метода газовой хромато-масс-спектрометрии с определением количественного содержания специфических маркеров: альдегидов, стеринов, карбоновых кислот [28]. Нижний предел чувствительности метода составляет 10⁴ КОЕ/мл.

Статистический анализ. Для сравнения групп использовали непараметрический Т-критерий Вилкоксона. Достоверными считали различия при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Исследование микрофлоры ротовой жидкости здоровых лиц молодого возраста (18-23 года) до приема иммуномодулятора ГМДП (Ликопид^® 1 мг, 10 дней, 1 раз в день) и через 4 дня после 10-дневного курса показало его влияние на состав микробного пейзажа 30 человек, что составляет 62,5% от общего количества участников исследования (табл.1). У 18 (37,5%) человек отсутствовал статистически значимый эффект ГМДП на микробный состав ротовой жидкости. Состав их микробиоценоза максимально приближался к нормоценозу: отсутствовали представители Candida albicans и грам-отрицательной микрофлоры, преобладали Firmicutes.

Достоверные изменения обнаружены для грибковой микрофлоры: количество лиц, у которых регистрировался Candida albicans, уменьшилось более чем в 5 раз (табл.1), при этом произошло замещение грибковой микрофлоры представителями лактобактерий и бифидобактерий. Статистически значимые изменения также зафиксированы для Clostridium spp: после применения ГМДП уменьшение представленности этого микроорганизма уменьшилось почти вдвое. Разнообразие микрофлоры повысилось у 73% молодых людей, основная доля микроорганизмов была представлена Streptococcus, Veillonella, Lactobacterium, Bifidobacterium. Наши данные согласуются с результатами других исследований, согласно которым в ротовой жидкости здоровых взрослых преобладающие таксоны принадлежали к Firmicutes (род Streptococcus; семейство Veillonellaceae, род Granulicatella), Proteobacteria (рода Neisseria, Haemophilus), Actinobacteria (рода Corynebacterium, Rothia, Actinomyces), Bacteroidetes, что дало основание E. Zaura и соавт. [18] выдвинуть концепцию "основного микробиоценоза" в состоянии здоровья. Достоверно уменьшилась обсемененность ротовой полости Porphyromonas gingivalis, присутствие которых часто регистрируется при заболеваниях пародонта [29], верхних отделов желудочно-кишечного тракта, дыхательных путей, толстой кишки, при болезни Альцгеймера и ревматоидном артрите [30].

Наблюдаемые под действием ГМДП изменения могут быть обусловлены воздействием препарата на иммунную систему человека, а также воздействием на представителей микробного сообщества. Известно, что ГМДП реализует свою активность через NOD2-рецепторы [31]. Поскольку мурамилпептиды - лиганды NOD2-рецептора - консервативны как у грам-положительных, так и у грам-отрицательных бактерий, NOD2 обнаруживает реагирование на большое разнообразие микроорганизмов [32]. Исследованы также другие сенсоры мурамилпептидов, ответственные за реализацию противоинфекционной защиты врожденного иммунитета [33]. Мурамилпептиды эффективны при лечении аллергических заболеваний [34] за счет смещения баланса Th1/Th2 [35], они используются в патогенетической терапии псориаза [36] и коррекции цитопений [37], потенцируют действие цитостатиков в терапии опухолей [38]. Анализ бактерицидной активности ротовой жидкости продемонстрировал эффективность использования препарата ГМДП в терапии заболеваний полости рта у пациентов с дисбактериозом слизистой оболочки [39]. В комплексной терапии пациентов с острыми одонтогенными периоститами [40] выявлена высокая клинико-иммунологическая эффективность ГМДП за счет восстановления параметров иммунного статуса в результате прироста числа Т-хелперов, образования адекватного уровня основных классов иммуноглобулинов и ликвидации дефектов фагоцитарной и микробицидной активности нейтрофильных гранулоцитов.

Эффективность мурамилпептидов и, в частности, ГМДП в коррекции патологий, связанных с иммунной системой, является основанием для широкомасштабных экспериментальных исследований, десятки статей ежегодно публикуются в научных журналах. В то же время воздействие мурамилпептидов на представителей бактериального сообщества не так широко отражено в научной литературе и, несомненно, представляет интерес. На сегодняшний день факторы, регулирующие состав микробиоценоза ротовой полости, привлекают особое внимание в связи со своей способностью оказывать существенное влияние на возникновение и течение патофизиологического процесса, а также возможностью выступать отягощающим фактором при хирургическом вмешательстве. К изучению этих процессов привлечены эксперты различных специальностей, в том числе системной биомедицины, использующие и формирующие электронные базы данных [41-43], что расширяет возможности экспериментальных и клинических исследований.

Заключение

Мы получили первое представление о влиянии низкомолекулярных регуляторов бактериального происхождения на состав микробиоценоза ротовой полости, имеющее прогностическое значение не только для диагностики воспалительных заболеваний, но и для разработки эффективных лечебно-профилактических мероприятий. Показано, что профилактическое использование препаратов на основе мурамилпептидов увеличивает разнообразие микрофлоры и уменьшает количество Candida albicans, Clostridium spp. и Porphyromonas gingivalis. Увеличение разнообразия способствует формированию нормобиоценоза, препятствуя заселению ротовой полости патогенной микрофлорой. Исследования в этом направлении представляют несомненный интерес, так как клиницисты получают инструмент целенаправленного регулирования микробного состава ротовой полости, что может быть использовано для терапии заболеваний различной этиологии и профилактики инфекционных осложнений при хирургическом вмешательстве.

Литература

1. Hooper L.V., Littman D.R., Macpherson A.J. Interactions Between the Microbiota and the Immune System. Science. 2012; 336: 1268-1273.

2. Ley R.E., Peterson D.A., Gordon J.I. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell. 2006; 124: 837-48.

3. Dethlefsen L., McFall-Ngai M., Relman D.A. An ecological and evolutionary perspective on human-microbe mutualism and disease. Nature. 2o07; 449: 811-8.

4. Macpherson A.J., Harris N.L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nat. Rev. Immunol. 2004; 4: 478-85.

5. Lima M. T., Andrade A.C.S.P., Oliveira G.P., Calixto R.S., Oliveira D.B., Souza E.L.S., et al. Microbiota is an essential element for mice to initiate a protective immunity against Vaccinia virus. FEMS Microbiology Ecology. 2016; 92 (2); fiv147.

6. Turnbaugh P.J., Backhed F., Fulton L., Gordon J.I. Diet-induced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome. Cell Host. Microbe. 2008; 3: 213-223.

7. Ley R.E. et al. Obesity alters gut microbial ecology. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: 11070-5.

8. Leystra A.A., Clapper M.L. Gut Microbiota Influences Experimental Outcomes in Mouse Models of Colorectal Cancer. Genes. 2019; 10 (11) 900: 1-20. doi: https://doi.org/10.3390/genes10110900

9. Uronis J.M., Muhlbauer M., Herfarth H.H., Rubinas T.C., Jones G.S. et al. Modulation of the intestinal microbiota alters colitis associated colorectal cancer susceptibility. PLoS ONE. 2009; 4: e6026.

10. Buffington S.A., Di Prisco G.V., Auchtung T.A., Ajami N.J., Petrosino J.F., Costa-Mattioli M. Microbial reconstitution reverses maternal diet-induced social and synaptic deficits in offspring. Cell. 2016; 165: 1762-1775. doi: 10.1016/j.cell.2016.06.001

11. Goodacre R. Metabolomics of a superorganism. J. Nutr. 2007; 137 (1 Suppl): 259S-66S.

12. Lederberg J. Infectious history. Science. 2000; 288 (5464): 287-293.

13. Carroll I.M., Threadgill D.W., Threadgill D.S. The gastrointestinal microbiome: a malleable, third genome of mammals. Mamm Genome. 2009; 20 (7): 395-403. doi: 10.1007/s00335-009-9204-7

14. Li J., Jia H., Cai X., Zhong H., Feng Q., Sunagawa S. et al. An integrated catalog of reference genes in the human gut microbiome. Nat. Biotechnol. 2014: 32: 834-841. doi: 10.1038/nbt.2942

15. Афанасьев С., Алешкин В.А., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С., Слободенюк В.В., Караулов А.В. Микробиоценозы открытых полостей имукозальныйиммунитет. Эффективная фармакотерапия. 2013; 27: 6-11.

16. Okereke I.C., MillerA.L., Hamilton C.F., BoothA.L., Reep G.L., Andersen C.L., et al. Microbiota of the Oropharynx and Endoscope Compared to the Esophagus. Sci Rep. 2019; 9: 10201. doi: 10.1038/s41598-019-46747-y

17. Lemon K.P., Klepac-Ceraj V., Schiffer H.K., Brodie E.L., Lynch S.V., et al. Comparative analyses of the bacterial microbiota of the human nostril and oropharynx. mBio. 2010; 1 (3): e00129-10. doi: 10.1128/mBio.00129-10.

18. Zaura E., Keijser B.J., Huse S.M., Crielaard W. Defining the healthy “core microbiome” of oral microbial communities. BMC Microbiol. 2009; 9: 259. doi: 10.1186/1471-2180-9-259

19. Бурмистрова А.Л., Филиппова Ю.Ю., Нохрин Д.Ю., Тимофеева А.В. Микробный социум экологической ниши: ротовая полость здоровых детей. Инфекция и иммунитет. 2018; 8 (1): 54-60. doi: 10.15789/2220-7619-2018-1-54-60

20. Борисова О.Ю., Алешкин В. А., Пименова А.С., Крюков А.И., Кунельская Н.Л., Гуров А.В., Шадрин Г.Б., и соавт. Микробный состав микрофлоры ротоглотки у больных с тонзиллярной патологией. Инфекция и иммунитет. 2015; 5 (3): 225-232. doi: 10.15789/2220-7619-2015-3-225-232

21. Segata N., Haake S.K., Mannon P., Lemon K.P., Waldron L., Gevers D., Huttenhower C., Izard J. Composition of the adult digestive tract bacterial microbiome based on seven mouth surfaces, tonsils, throat and stool samples. Genome Biol. 2012; 13 (6): R42. doi: 10.1186/gb-2012-13-6-r42

22. Girardin S.E., Sansonetti P.J., Philpott D.J. Intracellular vs extracellular recognition of pathogens-common concepts in mammals and flies Trends Microbiol. 2002; 10 (4): 193-9.

23. Negroni A., Pierdomenico M., Cucchiara S., Stronati L. NOD2 and inflammation: current insights. J. Inflamm. Res. 2018; 11: 49-60. doi: 10.2147/JIR.S137606

24. Biswas A., Liu Y.J., Hao L., Mizoguchi A., Salzman N.H., Bevins C.L., Kobayashi K.S. Induction and rescue of Nod2-dependent Th1-driven granulomatous inflammation of the ileum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010; 107 (33): 14739-44. doi: 10.1073/pnas.1003363107.

25. NikitushkinV.D.,Demina G.R., ShleevaM.O., KaprelyantsA.S., Guryanova S.V., Ruggiero A., Berisio R. A product of RpfB and RipA joint enzymatic action promotes the resuscitation of dormant mycobacteria. FEBS Journal. 2015; 282 (13): 2500-11.

26. Лугинова Е.Ф., Старостин В.П., Капустина М.И. Клинико-лабораторные проявления инфицирования лекарственноустойчивыми микобактериями туберкулеза у детей и эффективность комплексного превентивного лечения Дальневосточный медицинский журнал. 2010; (1): 25-8.

27. WMA Declaration of Helsinki - Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects. 2013; 310: 2191-2194.

28. Osipov G.A., Boiko N.B., Fedosova N.F., Kasikhina S.A., Lyadov K.V. Comparative gas chromatography-mass spectrometry study of the composition of microbial chemical markers infeces. Microb.Ecol. Health Dis.2009;21: 159-171. doi: 10.3109/08910600903462657

29. Naito M., Hirakawa H., Yamashita A. et al. Determination of the Genome Sequence of Porphyromonas gingivalis Strain ATCC 33277 and Genomic Comparison with Strain W83 Revealed Extensive Genome Rearrangements in P. gingivalis. DNA Research. 2008; 15 (4): 215-25.

30. Potempa J., Dragunow M., Curtis M.A., Faull R.L.M., Reynolds E.C., Walker G.D., et al. Porphyromonas gingivalis in Alzheimer disease brains: Evidence for disease causation and treatment with small-molecule inhibitors. Science Advances. 2019; 5 (1): eaau3333. doi:10.1126/sciadv.aau3333

31. Meshcheryakova E., Makarov E., Andronova T., Ivanov V., Philpott D. Evidence for correlation between the intensities of adjuvant effects and NOD2 activation by monomeric, dimeric and lipophylic derivatives of N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl peptides. Vaccine. 2007; 25 (23): 4515-20.

32. Al Nabhani Z., Dietrich G., Hugot J.P., Barreau F. Nod2: The intestinal gate keeper. PLoS Pathog. 2017; 13 (3): e1006177. doi: 10.1371/journal.ppat.1006177

33. Laman A.G., Lathe R., Shepelyakovskaya A.O., Gartseva A., Brovko F.A., Guryanova S., et al. Muramyl peptides activate innate immunity conjointly via YB1 and NOD2. Innate Immun. 2016; 30: 41-49. doi: 10.1177/1753425916668982

34. Колесникова Н.В., Козлов И.Г., Гурьянова С.В., Коков Е.А., Андронова Т.М. Клинико-иммунологическая эффективность и перспективы использования мурамилдипептидов в лечении атопических заболеваний. Медицинская иммунология. 2016; 18 (1): 15-20.

35. Гурьянова С.В., Козлов И.Г, Мещерякова Е.А., Алексеева Л.Г., Андронова Т.М. Глюкозаминилмурамилдипептид нормализует баланс ТЫАГк2 при атопической бронхиальной астме. Иммунология. 2009; (5): 305-8.

36. Guryanova S., Udzhukhu V., Kubylinsky A. Pathogenetic therapy of psoriasis by muramyl peptide. Frontiers in Immunology. 2019; 10: 1275-83. doi: 10.3389/fimmu.2019.01275

37. Манапова Э.Р., Фазылов В.Х., Гурьянова С.В. Цитопении и их коррекция при противовирусной терапии хронического гепатита С у пациентов с генотипом 1. Вопросы вирусологии. 2017; 62 (4): 174-8.

38. Козлов И.Г., Воронина Е.В., Валякина Т.И., Симонова М.А., Гурьянова С.В., Мещерякова Е.А., Андронова Т.М. Ликопид в иммунотерапии опухолей: обзор экспериментальных исследований (обзор литературы). Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2011; 10 (2): 32-8.

39. Рабинович О.Ф., Рабинович И.М., Абрамова Е.С. Применение ликопида в комплексной терапии дисбактериоза полости рта. Стоматология. 2013; 92 (1): 40-2.

40. Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Неделько Н.А. Способ иммунокоррекции ликопидом нарушений местного иммунитета у больных с острыми одонтогенными периоститами. Стоматолог-практик. 2006; 12 (148): 30-1.

41. Guryanova S.V, Guryanova A.S. Modern Approach to Systems Biology, chapter in: Biological Networks and Pathway Analysis. Springer / Eds.: Tatarinova T.V., Nikolsky Yu.. Nikolsky Yu. Publ. Humana Press Inc., Totowa, NJ, United States. 2017. doi: 10.1007/978-1-4939-7027-8_2

42. Namasivayam A.A., Peitsch M.C., Racero M.G., Biryukov M., Talikka M., Perez M.B. et al. Community-Reviewed Biological Network Models for Toxicology and Drug Discovery Applications. Gene Regulation and Systems Biology. 2016; 10: 51-66. doi: 10.4137/GRSB.S39076

43. Peterson D.A., Frank D.N., Pace N.R., Gordon J.I. Metagenomic approaches for defining the pathogenesis of inflammatory bowel diseases. Cell Host. Microbe. 2008; 3: 417-427.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)