Сопоставление трех видов клеточных тест-систем для оценки биологической активности агонистов рецептора NOD2

• Дагиль Юлия Алексеевна
• Пащенков Михаил Владимирович

Резюме

Введение. Агонисты рецептора NOD2 представляют собой перспективный класс активаторов врожденного иммунитета. Актуально создание тест-систем для качественного и количественного определения их биологической активности.

Цель работы - сопоставить основные характеристики трех видов репортерных клеток, предназначенных для оценки биологической активности агонистов NOD2: с эндогенной экспрессией NOD2, с временной гиперэкспрессией NOD2 и со стабильной гиперэкспрессией NOD2.

Материал и методы. Репортерные клетки с эндогенной экспрессией NOD2 (293Luc) были получены путем стабильной трансфекции клеток HEK-293T геном люциферазы под контролем NF- κB-зависимого промотора. Клетки с временной гиперэкспрессией NOD2 (293Luc-tNOD2) получали путем временной трансфекции клеток 293Luc плазмидой, кодирующей ген NOD2 под конститутивным промотором. При длительном культивировании NOD2-трансфицированных клеток с селективным антибиотиком были получены клетки, стабильно гиперэкспрессирующие NOD2 (293Luc-stNOD2). Для каждого вида клеток были получены контрольные клетки, позволяющие подтверждать активацию NF- κB через рецептор NOD2. Эти клетки стимулировали 24 ч агонистом NOD2 - мурамилдипептидом (МДП); на выходе измеряли люциферин-зависимую хемилюминесценцию клеточных лизатов.

Результаты. Фоновый сигнал у клеток 293Luc-tNOD2 и 293Luc-stNOD2 был повышен соответственно в 30 и в 170 раз по сравнению с клетками 293Luc, что указывает на активацию NF- κB в отсутствие агониста. В то же время предел количественного определения МДП в среде у клеток 293Luc-stNOD2 был на порядок меньше, чем у 293Luc (1,6 и 20 нМ соответственно). У систем с использованием клеток 293Luc и 293Luc-stNOD2 отмечались приемлемые значения правильности и повторяемости, тогда как клетки 293Luc-tNOD2 характеризовались неудовлетворительной повторяемостью, а также требовали повышенного расхода реактивов и рабочего времени.

Заключение. Клеточные линии 293Luc и 293Luc-stNOD2 могут использоваться для определения биологической активности агонистов рецептора NOD2.

Ключевые слова:NOD2; мурамилдипептид; NF-KB; люцифераза; врожденный иммунитет

Введение

Активаторы врожденного иммунитета представляют большой интерес как средства профилактики и лечения инфекционных заболеваний человека. Одной из наиболее разработанной в фармакологическом отношении групп этих препаратов являются агонисты рецептора NOD2 врожденной иммунной системы. Базовым агонистом этого рецептора является фрагмент бактериального пептидогликана - мурамилдипептид (МДП, или N-ацетил-D-мурамил-L-аланил-D-изоглутамин) [1]. В России из этой группы препаратов наиболее хорошо известен глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП, или N-ацетил-D-глюкозаминил-N-ацетил-D-мурамил-L-аланил-D-изоглутамин) [2]. В мире группа NOD2-агонистов представлена также препаратами мурабутид, ромуртид и мифамуртид [3-5]. Ведутся разработки других, более эффективных, агонистов, а также антагонистов рецептора NOD2 [6-8], что требует создания надежных, информативных и удобных в применении тест-систем для оценки биологической активности и фармакокинетики вновь создаваемых соединений.

Большинство рецепторов врожденного иммунитета, в том числе NOD2 и его ближайший родственник NOD1, передают сигнал в ядро при помощи факторов транскрипции семейства NF-кВ [9, 10]. Поэтому для оценки биологической активности различных активаторов врожденного иммунитета используются репортерные клеточные линии, в которых измеряемым параметром является NF-кВ-зависимая экспрессия репортерного белка, например люциферазы, щелочной фосфатазы или зеленого флюоресцентного белка. Для введения в клетки репортерных генов, регулируемых NF-кВ-зависимым промотором, используют плазмидные или вирусные векторы. Трансфекция репортерными конструкциями может быть временной (делается в каждом эксперименте, что повышает трудозатраты и снижает воспроизводимость) или стабильной. Последний вариант реализован в виде репортерных клеточных линий, созданных, в частности, фирмой Invivogen (США).

Для придания системе специфичности в отношении конкретного рецептора, как правило, прибегают к временной или стабильной гиперэкспрессии данного рецептора, для чего используют векторные конструкции, в которых экспрессия интересующего рецептора регулируется конститутивно активным промотором. Однако гиперэкспрессия рецептора может приводить к нежелательным последствиям, в частности к активации NF-kB в отсутствие специфических агонистов [9, 10]. Кроме того, репортерные клетки экспрессируют эндогенные рецепторы врожденного иммунитета, что в ряде случаев может затруднять интерпретацию результатов. Альтернативным подходом является использование эндогенной экспрессии интересующего рецептора репортерными клетками, без его искусственной гиперэкспрессии; специфичность таких систем контролируют созданием вариантов репортерных клеток с нокдауном или нокаутом данного рецептора.

В данной работе мы сравнили ключевые характеристики трех видов репортерных клеток, предназначенных для оценки биологической активности агонистов NOD2: 1) с использованием эндогенной экспрессии NOD2; 2) с использованием временной гиперэкспрессии NOD2; 3) с использованием стабильной гиперэкспрессии NOD2. Все три вида клеток получены на основе клеточной линии HEK-293T, стабильно трансфицированной репортерным геном люциферазы под контролем NF-кВ-зависимого промотора. Вариант 2 характеризуется наибольшими разбросами измеряемого показателя (хемилюминесценции) в пределах опыта, а также требует наибольших затрат времени и реактивов. Варианты 1 и 3 характеризуются хорошей вопроизводимостью и взаимно дополняют друг друга с точки зрения эффективного диапазона концентраций агониста, что позволяет применять их как для качественных, так и для количественных исследований агонистов NOD2-рецептора.

Материал и методы

Плазмиды и реактивы. Использовали следующие плазмиды: 1) pGL4.32[luc2P/NF-kB-RE/Hygro], кодирующую репортерный ген люциферазы (luc2P) под контролем NF-кВ-зависимого промотора (Promega, США); 2) pUNO-hNOD2a, кодирующую ген NOD2 человека под контролем конститутивного промотора (Invivogen, США); 3) контрольную плазмиду pcDNA3.1 (Life Technologies, Великобритания); 4) pcDNA3.3-Cas9n, кодирующую Cas9-никазу (Cas9n) [11]; 5) плазмиды pKS-gRNA-NOD2.1 и pKS-gRNA-NOD2.2, таргетирующие два близлежащих сайта в гене NOD2 человека [12]; 6) плазмиды pKS-gRNA-NOD1.1 и pKS-gRNA-NOD1.2, таргетирующие два близлежащих сайта в гене NOD1 человека [12]. N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамин (МДП) и бластицидин S были приобретены у фирмы Invivogen, липофектамин 2000, гигромицин В и рекомбинантный фактор некроза опухолей (ФНО) человека - у Life Technologies. N-ацетил-D-глюкозаминил-N-ацетил-D-сорбито-ламинил-D-лактоил-L-аланил-D-изоглутамил-мезо-диаминопимелиновая кислота (ГС-триДАП) была получена, как описано ранее [12] и любезно предоставлена к.х.н. В.Л. Львовым (Институт иммунологии).

Получение репортерных клеток, содержащих ген люциферазы под контролем NF-кВ-зависимого промотора. Клетки HEK293T культивировали в среде DMEM ("Панэко", Российская Федерация) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Sigma, США) и 10 % инактивированной фетальной телячьей сыворотки (PAA, Австрия). Клетки трансфицировали плазмидой pGL4.32[luc2P/NF-kB-RE/Hygro] в комплексе с липо-фектамином 2000 согласно инструкции производителя. Селекцию стабильных трансфектантов выполняли в присутствии 200 мкг/мл гигромицина В (Life Technologies). Полученную клеточную линию, названную 293Luc, далее вели с указанной концентрацией гигромицина В, пассируя 2-3 раза в нед.

Получение клеток 293Luc со стабильной гиперэкспрессией NOD2. Экспоненциально растущие клетки 293Luc высевали в 24-луночный планшет по 10⁵ на лунку. По достижении конфлюэнтности 50 % (примерно 2 - 10⁵ клеток на лунку) клетки трансфицировали плазмидой pUNO-hNOD2a в дозе от 4 - 10⁴ до 4 копий плазмиды на клетку в комплексе с липофектамином 2000. Через 2 дня начинали селекцию стабильных трансфектантов в присутствии гигромицина В и бластицидина S (10 мкг/мл). Минимальное количество плазмиды, при котором клетки приобретали резистентность к бластицидину S, составило 400 копий на клетку. Клеточная линия, трансфицированная указанной дозой плазмиды и стабильно растущая в присутствии гигромицина В и бластицидина S на 21-й день после трансфекции, была названа 293Luc-stNOD2 (stable NOD2). Полученная клеточная линия является аналогом клеточной линии HEK-Blue™ hNOD2 (Invivogen).

Получение вариантов клеток 293Luc с нокаутом генов NOD2 и NOD1. Для нокаутирования генов использовали технологию CRISPR-Cas9 [12, 13]. Вкратце, клетки 293Luc котрансфицировали плазмидами pcDNA3.3-Cas9n и двумя плазмидами, таргетирующими ген NOD2 или NOD1. Через 3 суток трансфицированные клетки пересевали для получения клеточных клонов. Через 3 нед собирали клоны, среди которых отбирали те, у которых отсутствовал ответ на специфический агонист нокаутируемого рецептора при сохранности ответа на ФНО. Наличие изменений геномных последовательностей генов NOD2 и NOD1 в отобранных клонах подтверждали путем секвенирования по Сэнгеру. В работе использовали по одному клону с нокаутом NOD2 и NOD1 (293Luc-ANOD2 и 293Luc-ANOD1).

Стимуляция клеток 293Luc и их вариантов с нокаутом гена NOD2 и со стабильной гиперэкспрессией NOD2. Клетки высевали в плоскодонные 96-луночные планшеты (SPL Life Sciences, Республика Корея) по 10⁴ клеток на 100 мкл на лунку. Через 48 ч, когда монослой достигал коэнфлюэнтности 70-80 %, добавляли МДП в необходимой конечной концентрации либо рекомби-натный ФНО человека в конечной концентрации 100 нг/мл (положительный контроль). В лунки отрицательного контроля добавляли DMEM в том же объеме. Все стимуляции делали в дублях или триплетах. Еще через 24 ч в лунки добавляли лизирующий субстрат Bright-Glo (Promega), полученные клеточные лизаты переносили в 96-луночные планшеты из белого пластика (SPL Life Sciences) и измеряли люциферазную активность (хемилюминесценцию) на приборе Lucy II (Anthos, Австрия). Результаты выражали в относительных световых единицах (ОСЕ). Для корректного сравнения экспериментов результаты нормализовали, принимая ответ данного вида клеток на ФНО в каждом эксперименте за 100 %.

Временная гиперэкспрессия NOD2 в клетках 293Luc в сочетании со стимуляцией МДП. Клетки с временной гиперэкспрессией NOD2 ниже называются 293Luc-tNOD2 (transient NOD2). Методика описана в других работах [14]. 96-луночные планшеты с клетками 293Luc готовили, как описано выше. В день эксперимента готовили комплексы, содержащие: 1) требуемое количество МДП (контроль - среда без МДП); 2) плазмиду pUNO-hNOD2a в количестве 2 нг/лунку или примерно 1,0-1,5 · 10⁴ копий на клетку (контроль -плазмида pcDNA3.1, 2 нг/лунку); 3) липофектамин 2000 (0,4 мкл/лунку). Комплексы добавляли к клеткам в течение 10-15 мин после приготовления. В качестве положительного контроля использовали ФНО. Через 24 ч измеряли люциферазную активность, как описано выше.

Анализ данных. Отношение сигнала к шуму рассчитывали как отношение ОСЕ в лунках с агонистами (МДП или ФНО) к OCE в лунках без агонистов (фон). Предел количественного определения (ПКО) устанавливали путем анализа образцов, не содержащих МДП и содержащих низкие концентрации МДП, все в 6 повторностях. ПКО определяли как наименьшую концентрацию МДП, при которой получаемый сигнал еще удовлетворял следующим 3 критериям [15]: 1) сигнал в любой из 6 лунок с данной концентрацией МДП должен быть выше, чем M + 1,645 σ фонового сигнала; 2) наличие высокодостоверного отличия сигнала при данной концентрации МДП от фонового сигнала (р < 0,001 при использовании t-критерия Стьюдента); 3) коэффициент вариации сигнала при данной концентрации МДП - не более 20 %. Правильность и повторяемость оценивали путем 6-кратного определения концентрации МДП в растворе, содержащем известное количество МДП. Правильность рассчитывали как M ± σ относительного отклонения измеренной концентрации МДП от фактической, выраженного в процентах. Повторяемость (сходимость) оценивали по коэффициенту вариации измеренной концентрации МДП (в процентах). Для статистического анализа использовали t-критерий Стьюдента.

Результаты

Базальные и индуцированные показатели хемилюминесценции у трех видов репортерных клеток. Отношение полезного сигнала к шуму

На рисунке и в табл. 1 показаны базальные и индуцированные показатели хемилюминесценции клеток 293Luc, 293Luc-tNOD2 и 293Luc-stNOD2.

Фоновый сигнал у клеток 293Luc-tNOD2 был примерно в 30 раз выше, а у клеток293Luc-stNOD2-в 170 раз выше, чем у клеток 293Luc (см. табл. 1). Таким образом, гиперэкспрессия NOD2 приводит к резкому повышению фоновой (в отсутствие специфического агониста) активации NF-kB.

ФНО индуцировал примерно одинаковую люциферазную активность во всех трех типах клеток (см. табл. 1). Однако, поскольку фоновые сигналы резко различались, отношение сигнала к шуму при стимуляции ФНО у клеток 293Luc составило 2450 ± 820, тогда как у клеток 293Luc-tNOD2 - 137 ± 91, а у клеток 293Luc-stNOD2 - всего 12,2 ± 3,7.

Зависимость ответа от логарифма концентрации МДП у клеток 293Luc, экспрессирующих эндогенный NOD2, носила характер сигмоидной функции (рисунок А). Верхнее плато ответа на МДП у клеток 293Luc не превышало 5 % от ответа на ФНО, EC₅₀ составила 0,18 ± 0,05 мкМ (lgEC₅₀ = -0,77 ± 0,14). Однако в связи с низкой базальной хемилюминесценцией клетки 293Luc характеризовались наибольшими среди трех видов клеток отношениями полезного сигнала к шуму при ответе на МДП (см. табл. 1).

Таблица 1. Функциональные свойства клеток 293Luc, 293Luc-tNOD2 и 293Luc-stNOD2*

Примечание. * - значения средних и стандартных отклонений рассчитаны по результатам 7-15 независимых экспериментов; ОСШ - отношение сигнала к шуму; ФНО - фактор некроза опухоли; здесь и в табл. 2: МДП - мурамилдипептид.

Примеры ответов клеток 293Luc, 293Luc-tNOD2 и 293Luc-stNOD2, а также соответствующих контрольных клеток на агонисты NOD-рецепторов.

А - ответ клеток 293Luc и контрольных клеток 293Luc-ANOD2 на мурамилдипептид (МДП); Б - ответ клеток 293Luc-stNOD2 и контрольных клеток 293Luc на МДП; В - ответ на МДП клеток 293Luc-tNOD2 и контрольных клеток 293Luc, трансфицированных плазмидой pcDNA3.1; Г - ответ клеток 293Luc, 293Luc-ANOD2 и 293Luc-ANOD1 на ГС-триДАП; Д - ответ клеток 293Luc-stNOD2 и контрольных клеток 293Luc на ГС-триДАП. На всех графиках показаны результаты 1 репрезентативного эксперимента из не менее чем 3 для каждой серии (M±σ по 3 повторностям в каждом эксперименте). На графиках А, Б, В и Д пунктирной линией отмечена средняя фоновая хемилюминесценция опытных клеток, точечно-пунктирной линией - средняя ФНО-индуцированная хемилюминесценция опытных клеток.

У клеток 293Luc-stNOD2 кривая ответа на МДП имела колоколообразную форму (см. рисунок Б). Максимум ответа на МДП, составляющий > 50 % ответа на ФНО, достигался при концентрации около 0,1 мкМ. При дальнейшем повышении концентрации МДП ответ падал, так что при концентрациях свыше 1 мкМ уровни хемилюминесценции были даже ниже базального, что может быть обусловлено истощением пулов сигнальных молекул при гиперактивации NOD2. Левая часть кривой "доза-ответ" аппроксимировалась сигмоидной функцией (рисунок Б), причем EC₅₀ была примерно на порядок ниже, чем у клеток 293Luc (EC₅₀ = 0,021 ± 0,008 мкМ, log₁₀EC₅₀ = -1,68 ± 0,15; см. табл. 1). Отношения сигнала к шуму у клеток 293Luc-stNOD2 были существенно ниже, чем у клеток 293Luc, за счет как более высокой базальной хемилюминесценции, так и аутоингибирования сигнала при высокой концентрации МДП.

Клетки 293Luc-tNOD2 занимали промежуточное положение по указанным показателям (см. табл. 1). При наиболее высокой исследованной концентрации МДП (2,5 мкМ) тоже отмечалась тенденция к аутоингибированию сигнала, хотя и не столь выраженная, как у клеток 293Luc-stNOD2 (рисунок В). Также у клеток 293Luc-tNOD2 обращают на себя внимание большие стандартные отклонения сигнала в пределах опыта, что указывает на низкую воспроизводимость методики.

Предел количественного определения

Предел количественного определения МДП составил у клеток 293Luc - 20 нМ, у клеток 293Luc-stNOD2 -1,6 нМ (см. табл. 1). Для клеток 293Luc-tNOD2 этот показатель не был точно определен, он находился в диапазоне 4-20 нМ.

Специфичность

Как любые другие клетки, клеточная линия HEK293T и ее модифицированные варианты экспрессируют не только NOD2, но и другие паттерн-распознающие рецепторы, стимуляция которых может приводить к активации NF-kB. В связи с этим необходима проверка специфичности сигнала, получаемого под действием исследуемых соединений.

При использовании линии 293Luc контролями специфичности служат варианты этой клеточной линии с нокаутами генов NOD2 и других паттерн-распознающих рецепторов. Например, клетки с нокаутом NOD2 (293Luc-ANOD2) не отвечают на МДП в концентрациях вплоть до 50 мкМ (см. рисунок А). Тем самым подтверждается, что МДП активирует NF-kB в клетках 293Luc исключительно через рецептор NOD2. Для сравнения, другое вещество мурамилпептидной природы, ГС-триДАП, тоже вызывает активацию NF-kB в клетках 293Luc, но эта активность сохраняется в клетках 293Luc-ANOD2 и исчезает в клетках 293Luc-ANOD1 с нокаутом гена NOD1, что указывает на избирательность ГС-триДАП по отношению к рецептору NOD1 (см. рисунок Г).

Контролем для клеток 293Luc-stNOD2 служат клетки 293Luc. Как было отмечено выше, клетки 293Luc-stNOD2 отвечают на МДП в концентрациях на порядок ниже, чем клетки 293Luc, что подтверждает активность МДП по отношению к рецептору NOD2 (см. рисунок Б). Вещество ГС-триДАП, являющееся агонистом NOD1, тоже активирует NF-kB и в клетках 293Luc, и в клетках 293Luc-stNOD2 (см. рисунок Д). Однако EC₅₀ для ГС-триДАП в клетках 293Luc-stNOD2 даже несколько выше, чем в клетках 293Luc (в опыте на рисунке Д - 2,54 мкМ и 1,43 мкМ соответственно). Следовательно, активация NF-kB в клетках 293Luc-stNOD2 под действием ГС-триДАП не обусловлена активацией NOD2.

Правильность и повторяемость

Для оценки правильности и повторяемости методик исследовали одно и то же разведение МДП в 6 повторностях (расчетная конечная концентрация МДП в среде составляла 100 нМ в случае клеток 293Luc и 293Luc-tNOD2 и 10 нМ в случае 293Luc-stNOD2), после чего по калибровочным кривым рассчитывали концентрацию МДП в среде. Как видно из табл. 2, клетки 293Luc и 293Luc-stNOD2 позволяли правильно определять концентрацию МДП в среде при достаточно хорошей повторяемости. В то же время клетки 293Luc-tNOD2 характеризовались неудовлетворительной повторяемостью, о чем свидетельствует высокий коэффициент вариации.

Обсуждение

NOD2-репортерные клеточные линии могут использоваться для решения нескольких задач: 1) фундаментальные исследования рецептора NOD2, в частности изучение его сигнальных путей; 2) изучение биологической активности вновь создаваемых агонистов и антагонистов NOD2, а также контроль качества производственных партий этих групп препаратов; 3) определение содержания агонистов NOD2 в биологических жидкостях. Различия свойств полученных клеточных линий определяют их сферы применения. Ниже мы исключаем из сравнения клетки 293Luc-tNOD2 с временной гиперэкспрессией NOD2, поскольку данная модель является наиболее затратной с точки зрения рабочего времени и расходных материалов и обладает наихудшей воспроизводимостью.

Изучение сигнальных путей рецептора NOD2. Клетки 293Luc характеризуются естественной экспрессией рецептора NOD2, низкой фоновой активацией NF-kB, а также высоким отношением сигнала к шуму при стимуляции классическим агонистом NOD2 (МДП), что позволяет использовать их для изучения сигнальных путей рецептора NOD2, например путем нокаутирования или ингибирования известных или предполагаемых компонентов сигнальных путей. Клетки 293Luc-stNOD2 менее пригодны для этой цели, поскольку избыточная экспрессия белка NOD2 может приводить к его неестественным взаимодействиям с другими белками, искажая естественную картину NOD2-зависимой передачи сигнала. Проявлением этого может служить высокая фоновая активация NF-kB в клетках 293Luc-stNOD2 в отсутствие специфического агониста, что уже было описано в литературе [9, 10].

Изучение биологической активности агонистов и антагонистов NOD2. Для определения биологической активности агонистов NOD2 пригодны обе клеточные линии. Хотя антагонисты NOD2 в работе не изучались за неимением коммерчески доступных соединений этого класса, есть основания для предположения, что и этот класс соединений может быть изучен с помощью полученных клеточных линий. Однако необходимо учитывать, что избыточная чувствительность клеток 293Luc-stNOD2 к агонистам NOD2 способна приводить к искажению показателей активности изучаемых соединений, в связи с чем требуется перепроверка данных, полученных с помощью 293Luc-stNOD2, на клетках 293Luc с естественной экспрессией NOD2, которая сопоставима с экспрессией NOD2 в макрофагах человека [12].

Определение агонистов NOD2 в биологических жидкостях. Как клетки 293Luc, так и клетки 293Luc-stNOD2 могут в перспективе быть использованы для количественного определения агонистов NOD2 в биологических жидкостях, например при фармакокинетических исследованиях. Оба вида клеток характеризуются приемлемыми показателями правильности и повторяемости. Предел определения МДП у клеток 293Luc и 293Luc-stNOD2 сопоставим или лучше, чем у систем, основанных на высокоэффективной жидкостной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии [16-18]. Хотя полезный диапазон каждой клеточной линии сравнительно невелик (20 нМ - 1 мкМ для клеток 293Luc, 1,6 нМ - 100 нМ для клеток 293Luc-stNOD2), параллельное тестирование образцов на двух клеточных линиях позволяет расширить его примерно до трех порядков. При использовании клеток 293Luc-stNOD2 возможно ошибочное занижение концентрации агониста, обусловленное колоколообразной зависимостью ответа от концентрации у клеток 293Luc-stNOD2, тогда как параллельное тестирование образцов на клетках 293Luc-stNOD2 и 293Luc позволит избежать этой ошибки, поскольку у клеток 293Luc отсутствует аутоингибирование сигнала вплоть до концентрации МДП 50 мкМ (данные не представлены).

Выводы

1. В работе получены репортерные клеточные линии с естественной экспрессией, с временной гиперэкспрессией и со стабильной гиперэкспрессией рецептора NOD2, а также соответствующие контрольные линии.

2. Полученные клеточные линии позволяют оценивать биологическую активность агонистов рецептора NOD2, а также могут быть использованы для других исследований, связанных с активацией этого рецептора. Наилучшими характеристиками по правильности и повторяемости обладают клеточные линии с естественной экспрессией NOD2 (293Luc) и со стабильной гиперэкспрессией NOD2 (293Luc-stNOD2).

3. Нижний предел количественного определения мурамилдипептида у клеточной линии с 293Luc составляет 20 нМ, у клеточной линии 293Luc-stNOD2 - 1,6 нМ. Диапазон измеряемых концентраций МДП при параллельном использовании двух клеточных линий варьирует от 1,6 до 1 мкМ.

Вклад авторов

Участие в получении репортерных клеточных линий, оценка их функциональных свойств, статистическая обработка данных, участие в написании статьи - Дагиль Ю.А.; общее руководство работой, получение репортерных клеточных линий, участие в статистической обработке результатов, написание статьи - Пащенков М.В.

Литература

1. Girardin S.E., Boneca I.G., Viala J., Chamaillard M., Labigne A., Thomas G. et al. Nod2 is a general sensor of peptidoglycan through muramyl dipeptide (MDP) detection. J. Biol. Chem. 2003; 278 (11): 8869-72.

2. Винницкий Л.И., Бунятян К.А., Пинегин Б.В., Миронова Е.В., Швец Л.И., Волков А.А. и др. Отечественный иммуномодулятор нового поколения Ликопид в комплексном лечении и профилактике инфекционных осложнений в хирургической клинике. Вестник Российской академии медицинских наук. 1997; (11): 46-9.

3. Bahr G.M., Darcissac E., Bevec D., Dukor P., Chedid L. Immunopharmacological activities and clinical development of muramyl peptides with particular emphasis on murabutide. Int. J. Immunopharmacol. 1995; 17 (2): 117-31.

4. Azuma I. Review: inducer of cytokines in vivo: overview of field and romurtide experience. Int. J. Immunopharmacol. 1992; 14 (3): 487-96.

5. Kager L., Potschger U., Bielack S. Review of mifamurtide in the treatment of patients with osteosarcoma. Ther. Clin. Risk Manag. 2010; 6: 279-86.

6. Kecek Plesec K., Urbancic D., Gobec M., Pekosak A., Tomasic T., Anderluh M. et al. Identification of indole scaffold-based dual inhibitors of NOD1 and NOD2. Bioorg. Med. Chem. 2016; 24 (21): 5221-234.

7. Wang S., Yang J., Li X., Liu Z., Wu Y., Si G. et al. Discovery of 1,4-benzodiazepine-2,5-dione (BZD) derivatives as dual nucleotide binding oligomerization domain containing 1/2 (NOD1/NOD2) antagonists sensitizing paclitaxel (PTX) to suppress Lewis lung carcinoma (LLC) growth in vivo. J. Med. Chem. 2017; 60 (12): 5162-92.

8. Rickard D.J., Sehon C.A., Kasparcova V., Kallal L.A., Zeng X., Montoute M.N. et al. Identification of benzimidazole diamides as selective inhibitors of the nucleotide-binding oligomerization domain 2 (NOD2) signaling pathway. PLoS One. 2013; 8 (8): e69619.

9. Ogura Y., Inohara N., Benito A., Chen F.F., Yamaoka S., Nunez G. Nod2, a Nod1/Apaf-1 family member that is restricted to monocytes and activates NF-kappaB. J. Biol. Chem. 2001; 276 (7): 4812-8.

10. Inohara N., Koseki T., del Peso L., Hu Y., Yee C., Chen S. et al. Nod1, an Apaf-1-like activator of caspase-9 and nuclear factor-kappaB. J. Biol. Chem. 1999; 274 (21): 14 560-7.

11. Tarasevich A., Filatov A., Pichugin A., Mazurov D. Monoclonal antibody profiling of cell surface proteins associated with the viral biofilms on HTLV-1 transformed cells. Acta Virol. 2015; 59 (3): 247-56.

12. Dagil Y.A., Arbatsky N.P., Alkhazova B.I., L’vov V.L., Mazurov D.V., Pashenkov M.V. The dual NOD1/NOD2 agonism of muropeptides containing a meso-diaminopimelic acid residue. PLoS One. 2016; 11 (8): e0160784.

13. Ran F.A., Hsu P.D., Wright J., Agarwala V., Scott D.A., Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 2013; 8 (11): 2281-308.

14. Girardin S.E., Travassos L.H., Herve M., Blanot D., Boneca I.G., Philpott D.J. et al. Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nod1 and Nod2. J. Biol. Chem. 2003; 278 (43): 41 702-8.

15. Armbruster D.A., Pry T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 2008; 29 (1): S49-52.

16. Курсаков С.В., Кузнецова Е.Г., Курылева О.М., Саломатина Л.А., Гурьянова С.В., Борисова О. и др. Разработка и валидация методики определения глюкозаминилмурамилдипептида в водных растворах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Иммунология. 2020; 41 (1): 74-82.

17. Fosset S., Fromentin G., Rampin O., Lang V., Mathieu F., Tome D. Pharmacokinetics and feeding responses to muramyl dipeptide in rats. Physiol. Behav. 2003; 79 (2): 173-82.

18. Fox A., Fox K. Rapid elimination of a synthetic adjuvant peptide from the circulation after systemic administration and absence of detectable natural muramyl peptides in normal serum at current analytical limits. Infect. Immun. 1991; 59 (3): 1202-5.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)