Иммунология

Введение. Каталоги распространенных и хорошо документированных HLA-аллелей используются в качестве референсных при анализе результатов HLA-типирования для разрешения неоднозначностей, а также при исследовании распространенности HLA-аллелей в мире. Для неродственной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток часто привлекаются зарубежные доноры, поэтому сведения о распределении HLA-аллелей в разных популяциях важны.

Цель - составить каталог распространенных и хорошо документированных HLA-аллелей русской популяции, сравнить с данными каталога Европейской федерации иммуногенетики (EFI-CWD).

Материал и методы. В исследование включены 10 795 потенциальных доноров костного мозга/гемопоэтических стволовых клеток, самоопределившихся как русские, типированных по генам HLA-А, -В, -С, -DRB1, -DQB1 в высоком разрешении методом NGS. 5273 донора рекрутированы в Нижнем Новгороде и Нижегородской области, 2577 доноров - в Москве и Московской области, 1968 доноров - в других областях ЦФО, 977 доноров - в иных областях России.

HLA-аллели отнесены к распространенным (определены с частотой не менее трех раз в каждой из первых трех выборок), хорошо документированным (определены не менее 5 раз или не менее трех раз в общем HLA-гаплотипе) или редким.

Результаты. Создан первый в России каталог распространенных и хорошо документированных HLA-аллелей. Из выявленных 412 HLA-аллелей к распространенным относился 101 аллель, 90 % распространенных аллелей в русской популяции совпадали с распространенными аллелями EFI-CWD, однако некоторые распространенные у русских аллели были редкими в EFI-CWD, и, наоборот, некоторые аллели, относящиеся к распространенным в EFI-CWD, относились к редким в русской популяции. Результаты указывают как на HLA-генетическую близость русских с другими европейскими популяциями, так и на то, что каталог EFI-CWD не может использоваться в качестве суррогатного для русской популяции.

Заключение. Только 90 % распространенных и 76 % распространенных и хорошо документированных аллелей в русской популяции совпадают с таковыми в каталоге EFI-CWD, что указывает на необходимость иметь собственный каталог распространенных и хорошо документированных HLA-аллелей для русской популяции.

Введение. Специфическое связывание белка А S. aureus с Fc-фрагментом IgG человека рассматривают в контексте возможности его функционирования в качестве внеклеточного Fc-рецептора.

Цель - оценка выработки клетками крови человека ряда цитокинов в присутствии человеческого сывороточного γ-глобулина и его металлокомплексов в условиях эквимолярного связывания белком А S. aureus.

Материал и методы. Работа выполнена на клетках периферической крови человека с использованием методов препаративной биохимии и химии белка, оптико-физических и иммунохимических методов, технологий индукции выработки цитокинов.

Результаты. Белок А S. aureus в условиях эквимолярного взаимодействия с человеческим сывороточным γ-глобулином и связывания его Fc-фрагмента образует характеристический комплекс, снижая вследствие этого индукционную активность γ-глобулина в отношении выработки клетками крови человека ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНОα и ИЛ-10. Образование металлокомплексов γ-глобулина меняет компактность пространственной упаковки белковой глобулы, в результате чего связывание лиганда белком А S. aureus частично утрачивает свою эффективность.

Заключение. Образование металлокомплексов γ-глобулина создает препятствия его эквимолярному связыванию белком А S. aureus и снижает эффект блокирования в механизмах индукции выработки цитокинов, запускаемой взаимодействием Fc-рецепторов клетки со специфическим лигандом.

Введение. Под клеточным старением понимают необратимую утрату клетками способности пролиферировать, вызванную стрессовыми воздействиям. Накопление стареющих клеток описано при различных воспалительных заболеваниях и может быть как следствием воспаления, так и способствовать его поддержанию, что обусловлено повышенной продукцией провоспалительных цитокинов стареющими клетками.

Цель исследования - провести количественную и качественную оценку стареющих субпопуляций мононуклеарных клеток (МНК) крови у пациентов с хроническим воспалительным заболеванием кожи - атопическим дерматитом.

Материал и методы. МНК крови выделяли из гепаринизированной венозной крови пациентов и здоровых доноров в градиенте плотности фиколла. Для выявления стареющих клеток МНК окрашивали конъюгатами антител к поверхностным маркерам (CD3, CD56, CD14, CD19) и к внутриклеточным белкам - маркерам клеточного старения (p21^WAF1/CIP1, р16^INK4A), после чего анализировали методом проточной цитометрии. Активность β-галактозидазы, ассоциированной со старением, оценивали с помощью проточной цитометрии после инкубации клеток со специфическим флуорогенным субстратом. Уровень ИЛ-6 в плазме крови оценивали методом иммуноферментного анализа.

Результаты. Стареющие клетки с фенотипом p21⁺p16⁺ были обнаружены во всех исследованных субпопуляциях МНК периферической крови как у здоровых доноров, так и у пациентов. В субпопуляции CD3⁺CD56⁺-Т-клеток у пациентов число стареющих клеток было достоверно повышено по сравнению с одноименной субпопуляцией у здоровых доноров. Активность β-галактозидазы, ассоциированной со старением, в субпопуляциях моноцитов, Т- и НК-клеток у пациентов коррелировала со степенью тяжести заболевания. В группе пациентов с атопическим дерматитом была выявлена умеренная положительная корреляция уровней ИЛ-6 в плазме с возрастом, которая отсутствовала в группе здоровых доноров.

Заключение. Впервые проведена количественная оценка стареющих клеток среди МНК крови у пациентов с атопическим дерматитом. Выявлено повышенное содержание стареющих клеток в субпопуляции CD3⁺CD56⁺-Т-клеток у пациентов по сравнению со здоровыми донорами.

Введение. Аллергические заболевания дыхательных путей, вызванные гиперчувствительностью к аэроаллергенам - это самое распространенное проявление атопии среди детей и взрослых. Бронхиальная астма (БА) остается одной из актуальных медико-социальных проблем XXI в. На сегодняшний день БА считают одним из самых распространенных хронических заболеваний, которым в мире страдает более 348 млн человек (GINA, 2023). Возможной причиной данной тенденции принято считать урбанизацию. Несмотря на многочисленность эпидемиологических, клинических, иммуногенетических исследований, их результаты противоречивы, а генетические основы формирования БА с учетом этнической принадлежности и генетических особенностей пациентов в Узбекистане пока недостаточно изучены. Это требует выявления новых иммунологических и наследственных механизмов развития данного заболевания для разработки эффективных фармакотерапевтических мероприятий с использованием персонифицированной терапии.

Внедрение в последние годы генно-инженерных иммунобиологических препаратов (ГИБП) в схему лечения пациентов с БА способствует значительной редукции симптомов, предотвращению обострений и повышению качества жизни пациентов. В основе различных клинических проявлений атопической БА лежит высвобождение воспалительных медиаторов в результате взаимодействия IgE, связанного с рецепторами тучных клеток и базофилов, с инициирующим аллергеном. Создание омализумаба (анти-IgE) - человеческих рекомбинантных моноклональных антител против IgЕ - определило возможность вмешательства в развитие аллергического ответа на уровне эффекторной фазы.

Цель исследования - оценка эффективности таргетной терапии препаратом Генолар^® (биоаналог омализумаба) у пациентов с атопической БА в зависимости от климатогеографических особенностей в Узбекистане.

Материал и методы. С января 2022 г. по март 2023 г. было проведено обследование 100 пациентов с аллергическими заболеваниями, из них 38 детей в возрасте 2-18 лет, среди которых был верифицирован аллергический ринит (АР) у 20 детей (2-18 лет), у 12 детей (2-18 лет) - интермиттирующая БА, у 6 детей (2-18 лет) - атопический дерматит (АтД), и 62 взрослых пациента, среди которых 32 (19-59 лет) - с АР , 13 (19-59 лет) - с БА, 17 (19-59 лет) - с АтД. Для оценки таргетной терапии препаратом Генолар^® из этой когорты были отобраны пациенты с атопической БА. Для исследования общего IgE в сыворотке крови использовали тест-системы AccuBind ELISA Microwells (Monobind, США); аллерген-специфические IgE определяли с помощью тест-систем АллергоИФА-специфические IgE ("Алкор Био", Россия), для скарификационного кожного тестирования применяли стандартные диагностические аллергены (АО НПО "Микроген", Россия).

В 2020 г. российская компания "Генериум" разработала и зарегистрировала на территории РФ биоаналог омализумаба под торговым названием Генолар^®. Клиническое исследование этого препарата проводили в Республиканском научно-специализированном аллергологическом центре Минздрава Узбекистана у пациентов с тяжелой неконтролируемой БА. В наше исследование были включены 20 пациентов в возрастной категории от 10 до 54 лет с подтвержденной неконтролируемой тяжелой атопической БА (ACQ-5, ОФВ₁ < 80 % от должных величин). Диагноз и степень тяжести установлены в соответствии критериям GINA (2022), у пациентов выявлена поливалентная сенсибилизация, подтвержденная методом молекулярной аллергодиагностики и кожным прик-тестированием, и повышенный уровень общего IgE.

Всем пациентам при соответствии критериев включения/невключения в терапию был добавлен препарат Генолар^®, доза и кратность введения которого были подобраны индивидуально с учетом массы тела пациента и исходного уровня общего IgE. На основании улучшения состояния пациента, которое определялось по изменениям показателей функции внешнего дыхания, пиковой скорости выдоха, результатов опросника ACQ-5, уменьшением количества ночных и дневных обострений БА, проводилась оценка эффективности таргетной терапии. Все пациенты были проинформированы о препарате и дали письменное согласие на участие в 12-недельном клиническом исследовании.

Результаты. Все пациенты, получившие лечение препаратом Генолар^®, отметили значительное уменьшение выраженности симптомов БА. Уже через 1 мес от начала терапии продемонстрировано снижение ночных и дневных приступов, уменьшение одышки, потребности в короткодействующих β₂-агонистах. Средний показатель ACQ-5-теста через 1 мес в сравнении с исходными данными составил 2,46 баллов с тенденцией к дальнейшему уменьшению при продолжении терапии и к 3-му месяцу достиг 0,95 баллов.

Заключение. При оценке объема применяемой противоастматической базисной терапии на фоне приема препарата Генолар^® появилась возможность деэскалации дозы глюкокортикоидов для системного применения (сГКС) вплоть до полной отмены у 9 пациентов. Снижение дозы было начато через 4 нед от старта терапии по индивидуальной схеме в зависимости от исходной дозы и при сохранении контроля симптомов БА. У 17 пациентов удалось уйти от дополнительного контролирующего препарата (монтелукаста). В связи с улучшенным контролем симптомов пациенты не имели необходимости внепланового обращения за медицинской помощью по поводу БА, не нуждались в вызовах скорой медицинской помощи и не были госпитализированы при обострении БА. Среди пациентов обследованной группы, как у детей, так и у взрослых, выявлена высокая степень сенсибилизации к бытовым аллергенам, что отражает климатогеографические особенности Республики Узбекистан.

Введение. Фиброз ткани считается элементом не только репарации, но и многих патологий, в частности лейомиомы матки, ввиду чего одним из актуальных векторов исследования является уточнение механизма регуляция макрофагами процесса фиброзирования.

Цель исследования - оценить влияние эндометриальных макрофагов на синтез и продукцию коллагена в первичной культуре аутологичных лейомиоцитов.

Материал и методы. В исследовании принимали участие 25 женщин репродуктивного возраста с симптомной интрамуральной лейомиомой матки. Методом иммуноферментного анализа оценивали концентрацию коллагена в супернатантах 24- и 72-часовых культур миофибробластов, сокультивированных с аутологичными макрофагами эндометрия. Уровень мРНК Col 1A1 оценивали методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени.

Результаты. Под влиянием аутологичных эндометриальных макрофагов снижалась продукция коллагена в 24- и 72-часовых культурах миофибробластов миоматозного узла. Однако повышение продукции и синтеза коллагена на 3-и сутки инкубации под влиянием макрофагов позволяет предположить, что эффект угнетения носит временный характер и напрямую связан с регуляцией активности макрофагов.

Заключение. Эндометриальные макрофаги способны подавлять синтез и продукцию коллагена I типа миофибробластами миоматозного узла.

Введение. Способность иммунных клеток уничтожать опухолевые клетки за счет распознавания опухолевых антигенов T-клеточным рецептором (TCR) и передача активирующих сигналов внутрь клетки лежит в основе современной иммунотерапии онкологических заболеваний. Развитие технологии изоляции и клонирования рецепторов Т-клеток и генной инженерии позволило создать Т-клетки пациентов, кодирующие TCR к опухолевым антигенам, способные эффективно уничтожать опухолевые клетки.

Цель - получение генетически модифицированных TCR-T-клеток, нацеленных на распознавание эпитопов антигенов, ассоциированных с меланомой, с помощью индукции антиген-специфических Т-клеток и секвенирования РНК единичных клеток.

Материал и методы. Мононуклеарные клетки периферической крови здоровых доноров с генотипом HLA-A02 были использованы для генерации дендритных клеток, нагруженных пептидами целевых антигенов и последующей клональной экспансии антиген-специфических T-клеток. Анализ последовательности TCR проводили с помощью РНК-секвенирования единичных клеток. Биоинформатический анализ с использованием разных подходов позволил получить последовательности TCR для последующего клонирования и экспрессии в лентивирусном векторе. Полученные векторы были использованы для трансдукции Т-клеток и оценки цитотоксической активности против клеточных линий меланомы с наличием экспрессии PRAME и MART-1 [SK-Mel-5 и SK-Mel-37, предоставлены профессором Х. Шику из коллекции Высшей школы медицины Университета Миэ (Япония)]. Трансдуцированные T-клетки культивировали с опухолевыми клетками в соотношении 10 : 1, а цитотоксический эффект оценивали по уровню фермента лактатдегидрогеназы, который выделяется из лизированных клеток.

Результаты. В результате клональной экспансии было получено практически 1000-кратное обогащение исходной популяции антиген-специфических клеток. Клетки со стабильной экспансией специфических TCR и пролиферативной активностью были использованы для анализа транскриптома на платформе BD Rhapsody. Для определения оптимальной стратегии выбора антиген-специфических TCR мы использовали нейросеть ERGO-II, предсказывающую аффинитет TCR к целевому пептиду антигена PRAME, и определяли доминантность клонотипа для TCR, распознающих MART-1. Трансдукция Т-лимфоцитов лентивирусными конструкциями, кодирующими полученные TCR, привела к лизису не менее 30 % клеток-мишеней в первые же сутки взаимодействия с опухолевыми клетками.

Заключение. Мы достигли значительного обогащения популяции целевых антиген-специфических клеток в количествах, достаточных для проведения анализа транскриптома единичных клеток и клонотипов Т-клеток. С помощью технологии секвенирования РНК единичных клеток получили подробную информацию о последовательности каждого TCR и иммунном транскриптоме единичной Т-клетки, что позволило точно сконструировать полученные клоны TCR, оценить функциональное состояние клеток и улучшить отбор клонов-кандидатов TCR. Полученные последовательности для TCR были использованы для наработки лентивирусных конструкций, показавших свою эффективность при взаимодействии Т-клеток, трансдуцированных этими конструкциями, с клетками-мишенями.

Введение. Адоптивный перенос аутологичных модифицированных ex vivo химерным антигенным рецептором (CAR) Т-клеток представляет собой перспективный подход к терапии гематологических злокачественных новообразований, однако лечение солидных опухолей остается затруднительным. Дисиалоганглиозид (GD2) является потенциальной мишенью для CAR-T-клеточной терапии солидных опухолей, поскольку наблюдается высокая степень гомологии между антигенами человека и мыши. Сингенная модель на мышах с гомологичным антигеном как дополнительный метод доклинических исследований открывает широкие перспективы для оптимизации технологии CAR-T, что, в свою очередь, может способствовать успешному проведению клинических исследований в области терапии солидных новообразований.

Цель исследования - оценка фенотипических и цитотоксических свойств GD2-специфичных CAR-T-клеток мыши in vitro и их антиген-специфической противоопухолевой активности in vivo в сингенной модели меланомы B78-21.

Материал и методы. В работе были использованы мыши линии C57Bl/6. CD3⁺-лимфоциты мыши, выделенные с помощью магнитной сепарации, были трансдуцированы ретровирусным вектором, кодирующим GITR-лиганд (GITRL) и специфичный CAR-рецептор к молекуле GD2. Фенотип GD2-специфичных CAR-T-клеток по маркерам Т-клеток памяти (CD44 и CD62L) и истощения (PD-1 и TIM-3) был проанализирован методом проточной цитометрии. In vitro цитотоксические характеристики трансдуцированных клеток после сокультивирования с клетками-мишенями (GD2⁺-клетки B78-21 и GD2^--клетки B78-P4) были оценены по содержанию лактатдегидрогеназы в кондицио­нированных средах и методом проточной цитометрии на наличие экспрессии маркеров активации (CD69, CD137, CD154) и цитотоксичности (CD107a, CD178). Противоопухолевая активность in vivo была исследована с использованием GD2-позитивной сингенной модели меланомы B78-21 и однократного введения GD2-специфичных CAR-T-клеток в дозе 5 - 10⁶ клеток на мышь.

Результаты. В результате ретровирусной трансдукции была получена популяция CAR-T-клеток мыши, в которых доля CD8⁺-клеток в 2 раза превышает долю CD4⁺-клеток. В этой популяции преобладают CD44⁺CD62L^--клетки эффекторной памяти, однако после трансдукции наблюдается увеличение доли CD44⁺CD62L⁺-клеток центральной памяти, а также клеток, экспрессирующих маркер истощения TIM-3. После контакта с GD2⁺-клетками-мишенями достоверно увеличивается доля трансдуцированных клеток, экспрессирующих маркеры активации CD69, CD137, CD154 и маркер цитотоксичности CD107a, и наблюдается тенденция к повышению экспрессии CD178. Оценка цитотоксичности in vitro демонстрирует не только цитотоксический потенциал трансдуцированных Т-клеток, но и наличие антигенной специфичности в отношении опухолевых GD2⁺-клеток. Противоопухолевая активность CAR-T-клеток мыши in vivo проявилась в способности сдерживать рост опухолевого узла, а выживаемость мышей-опухоленосителей составила 85 дней. Медиана общей выживаемости мышей после инфузии трансдуцированных клеток составила 61,5 дня, что вдвое превышает показатели контрольных групп.

Заключение. Полученные CAR-T-клетки мыши имеют фенотип цитотоксических Т-лимфоцитов и проявляют антиген-специфические свойства как в отношении линий опухолевых GD2⁺-клеток in vitro, так и в сингенной модели меланомы B78-21 in vivo.

В обзоре представлен обобщенный материал по индукции толерантности к аллотрансплантатам в моделях на крупных лабораторных животных - свиньях и нечеловекообразных приматах в доклинических исследованиях. Поскольку прогресс в клинической трансплантологии невозможен без применения поэтапных исследований в доклинических моделях на крупных животных, эксперименты на этих моделях по-прежнему актуальны.

Методика индукции толерантности, изложенная в данном обзоре, заключается в формировании химеризма у реципиентов после пересадки гемопоэтических стволовых клеток, основанного на удалении in vivo вновь образующихся донор-реактивных Т-лимфоцитов при их взаимодействии в тимусе с донорскими антиген-презентирующими клетками, с параллельным развитием толерантности к пересаженному от того же донора органу.

Изложенные данные показывают, что трансплантация гемопоэтических стволовых клеток является реальной альтернативой пожизненному применению иммуносупрессивных препаратов. Необходимо продолжать исследования с целью выяснения иммунологических механизмов формирования толерантности, основанной на смешанном химеризме, чтобы использовать потенциальные мишени и необходимые манипуляции для будущих стратегий индукции толерантности. Знания, полученные с помощью моделей на крупных животных, могут иметь непосредственное отношение к различным вариантам донорских трансплантаций у человека и значительно увеличат внедрение протоколов индукции толерантности для предотвращения отторжения донорских органов и комплексов тканей.

Введение. В связи с распространением антибиотикорезистентности становится актуальным поиск новых антибактериальных вакцин и адъювантов. Одно из перспективных направлений - создание иммунотропных препаратов на основе липополисахарида (ЛПС) грам-отрицательных бактерий, который является мощным иммуностимулятором и способствует выработке протективных антител. Однако клиническое применение ЛПС ограничено его крайне высокой токсичностью, которую можно снижать путем модификации структуры липида А. В настоящее время получены детоксифицированные ЛПС (д-ЛПС) и липиды А (д-ЛА), которые широко используются в вакцинных препаратах: д-ЛПС - в качестве активной субстанции, д-ЛА - в качестве адъюванта. Помимо этого, изучается возможность применения д-ЛПС и д-ЛА в роли встроенных адъювантов.

Строение и биологическая активность ЛПС грам-отрицательных бактерий. ЛПС построен из трех различных фрагментов: липида А, олигосахарида кора и О-специфического полисахарида. Углеводная часть ЛПС обеспечивает серологическую специфичность различных штаммов, липид А активирует расположенный на поверхности иммунокомпетентных клеток комплекс TLR4/MD-2. Биологическая активность липида А тесно связана с его структурой - при уменьшении числа остатков жирных кислот и фосфорной кислоты снижается токсичность ЛПС. Так, классический, высокотоксичный липид А E. coli построен из двух остатков глюкозамина, к которому присоединено 6 остатков жирных кислот и 2 остатка фосфорной кислоты.

Методы получения детоксифицированных липидов А. Получение д-ЛА включает два направления: удаление остатков жирных кислот при сохранении обоих остатков фосфорной кислоты или удаление фосфатной группы при сохранении состава жирных кислот. Оба подхода были успешно реализованы для получения клинически применимых д-ЛА - OM-174 (д-ЛА с 3 остатками жирных кислот и 2 остатками фосфорной кислоты) и MPL (д-ЛА с 6 остатками жирных кислот и 1 остатком фосфорной кислоты).

Методы получения детоксифицированных ЛПС. Получение д-ЛПС также включает удаление жирных кислот или остатков фосфорной кислоты различными методами: химическими, ферментативными и генно-инженерными.

Заключение. Таким образом, препараты на основе д-ЛПС и д-ЛА являются перспективной платформой для создания новых, высокоиммуногенных антибактериальных вакцин и других иммунотропных препаратов. Поскольку получение этих соединений сопряжено с рядом недостатков (длительность, дороговизна, токсичность применяемых реактивов), становится актуальной разработка новых методов получения д-ЛПС и д-ЛА.