Иммунология

Введение. Сочетания агонистов NOD- и Toll-подобных рецепторов являются мощными активаторами макрофагов. Однако в литературе отсутствует подробная характеристика изменений транскриптомов макрофагов под действием данных сочетаний агонистов.

Цель исследования - выявить и сопоставить группы генов, характеризующихся увеличением и уменьшением экспрессии при сочетанной стимуляции макрофагов человека агонистами рецепторов NOD1 и TLR4 in vitro.

Материал и методы. Макрофаги, полученные из моноцитов крови здоровых доноров, стимулировали агонистами NOD1 и TLR4 раздельно и в сочетании в течение 1 и 4 ч. Транскриптомы анализировали с помощью высокопроизводительного секвенирования РНК (RNA-seq) и методов биоинформатики.

Результаты. При стимуляции макрофагов комбинацией агонистов NOD1 + TLR4 были идентифицированы 2 группы генов (> 500 генов в каждой), характеризующихся повышением и понижением экспрессии. Индуцибельная группа была обогащена генами, кодирующими ключевые медиаторы воспаления, за исключением типичных маркеров M1-активации. Репрессибельная группа была обогащена генами-регуляторами клеточного цикла. С помощью методов биоинформатики идентифицированы механизмы, которые могут лежать в основе транскрипционного репрограммирования макрофагов в данных условиях стимуляции.

Заключение. Сочетание агонистов рецепторов NOD1 и TLR4 вызывает транскриптомное репрограммирование макрофагов, соответствующее активации по врожденному типу.

Введение. Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) - один из самых распространенных патогенов, поражающих верхние и нижние дыхательные пути. Один из перспективных подходов к созданию противовирусных препаратов - применение молекул малых интерферирующих РНК (миРНК), способных специфично блокировать экспрессию генов вируса. Еще один подход - применение природных и синтетических пептидов в качестве противовирусных средств. Примечательно, что пептиды могут обладать несколькими биологическими свойствами. Например, мы показали, что катионный дендримерный пептид LTP не только обладал противовирусными свойствами в отношении РСВ, но и был способен транспортировать нуклеиновые кислоты в эпителиальные клетки.

Цели данного исследования - создание комплекса бифункционального пептида LTP и молекул миРНК, направленных против жизненно важных генов РСВ, а также изучение противовирусных свойств этого комплекса in vitro.

Материал и методы. Оптимальное соотношение компонентов в комплексе миРНК/пептид определяли с помощью трансфекции клеток эукариот. Токсическое воздействие комплекса на клетки изучали стандартным методом in vitro (МТТ-тест). Противовирусные свойства комплекса оценивали в модели РСВ-инфекции in vitro, вирусную нагрузку - с помощью титрования на монослое чувствительных клеток и количественного ПЦР-анализа.

Результаты. Показано, что оптимальным соотношением компонентов в комплексе миРНК/LTP является 1/12,5 по массе. При таком соотношении молекулы миРНК и пептида образуют наноструктуры диаметром 714 ± 125 нм, которые имеют положительный заряд 16,9 ± 6,71 мВ. Такие физико-химические характеристики позволяют комплексу проникать внутрь клеток. По итогам изучения цитотоксичности продемонстрировано, что комплекс и его отельные компоненты являются нецитотоксичными в концентрациях, оказывающих противовирусный эффект. При изучении противовирусных свойств in vitro показано, что комплекс миРНК/пептид обеспечивал более выраженное подавление репликации вируса в сравнении со свободным пептидом. Усиленный противовирусный эффект комплекса достигается за счет того, что пептид обладает собственными противовирусными свойствами и дополнительно транспортирует в зараженные клетки молекулы миРНК, блокирующие репликацию генома вируса.

Заключение. Комплекс бифункционального пептида LTP и молекул миРНК, направленных против жизненно важных генов РСВ, обеспечивает более выраженный противовирусный эффект по сравнению со свободным пептидом.

Введение. Рекомбинантные аденовирусные векторы являются одной из ведущих технологических платформ при разработке и производстве современных вакцин. В России и в других странах мира на базе рекомбинантных аденовирусов созданы и зарегистрированы вакцинные препараты против вируса лихорадки Эбола и коронавирусной инфекции SARS-CoV-2. Проводятся клинические испытания вакцин против гриппа, вируса Марбург, вирусов папилломы человека.

Закодированный в ДНК аденовирусного вектора целевой антиген экспрессируется в организме вакцинированного и против этого целевого белка-антигена развиваются адаптивные иммунные реакции. Векторная частица является вирусной и содержит в себе десятки вирусных антигенов. Следовательно, наряду с иммунными реакциями на целевой антиген в организме вакцинированного могут развиваться иммунные реакции на антигены самого вектора.

Цель данной работы - исследовать, как соотносятся между собой по интенсивности и качеству две разнонаправленные по антигенной специфичности иммунные реакции: против целевого антигена коронавируса и антигенов аденовирусного вектора.

Материал и методы. У мышей C57BL/6 исследовали интенсивность иммунных реакций CD4- и CD8-Т-клеток в ответ на иммунизацию рекомбинантным аденовирусным вектором, кодирующим S-белок SARS-CoV-2 (Ad5-S). Через 2 и 3 мес после иммунизации в селезенке мышей определяли количество и антигенную специфичность CD4- и CD8-T-клеток памяти. Реакцию Т-клеток индуцировали in vitro в совместной культуре с антиген-презентирующими дендритными клетками. Очищенные популяции CD4- и CD8-T-клеток получали сортировкой на лазерном проточном сортировщике BD FACS Aria II. Антиген-презентирующие клетки трансдуцировали аденовирусным вектором Ad5-S, кодирующим S-белок коронавируса, или контрольным рекомбинантным аденовирусным вектором без целевой вставки (Ad5-0). Ответ Т-клеток определяли методом ELISPOT по числу клеток, секретирующих ИФН-γ. В отдельных экспериментах для реактивации CD4-Т-клеток антиген-презентирующие дендритные клетки нагружали рекомбинантным RBD-фрагментом S-белка SARS-CoV-2. Для усиления ответа Т-клеток антиген-презентирующие дендритные клетки стимулировали агонистом TLR4.

Результаты. Установлено, что однократная интраназальная иммунизация вектором Ad5-S в дозе 10⁸ БОЕ индуцирует сильные системные Т-клеточные иммунные реакции у мышей C57BL/6. Через 2 мес после иммунизации в селезенке мышей обнаруживается около 100-200 тыс. антиген-реактивных Т-клеток памяти, секретирующих ИФН-γ при реактивации in vitro дендритными клетками, презентирующими целевой S-антиген SARS-CoV-2. Большинство антиген-реактивных CD8-T-клеток памяти специфично к S-антигену SARS-CoV-2. Содержание таких клеток после иммунизации вектором Ad5-S превышает 1 % от всех CD8-T-клеток. Количество антиген-реактивных CD8-T-клеток памяти, специфичных к аденовирусным антигенам вектора, было приблизительно в 3 раза ниже, чем количество антиген-реактивных CD8-T-клеток памяти, специфичных к целевому S-антигену. Интенсивность иммунной реакции CD4-T-клеток на иммунизацию вектором Ad5-S была сравнима с интенсивностью иммунной реакции CD8-T-клеток. Подавляющее большинство антиген-реактивных CD4-T-клеток памяти было специфично к антигенам аденовирусного вектора. Эти CD4-Т-клетки секретировали ИФН-γ в ответ на рестимуляцию in vitro дендритными клетками, трансдуцированными рекомбинантным аденовирусным вектором Ad5-0 без целевой вставки. Число CD4-T-клеток, реагирующих на рестимуляцию дендритными клетками, нагруженными рекомбинантным RBD, было исчезающе малым.

Показана возможность повышения интенсивности ответа CD8-T-клеток, специфичных к целевому S-антигену, путем увеличения дозы вектора Ad5-S при трансдукции антиген-презентирующих дендритных клеток, а также путем использования TLR4-агониста для стимуляции антиген-презентирующих дендритных клеток.

Предложены возможные механизмы кооперативного взаимодействия CD8-T-клеток, специфичных к целевому S-антигену SARS-CoV-2, и CD4-T-клеток, специфичных к антигенам аденовирусного вектора. Рассматриваются возможные пути усиления ответа CD4-T-клеток на целевой S-антиген.

Введение. В литературе довольно подробно описана роль отдельных цитокинов в индукции дифференцировки различных субпопуляций В-клеток в плазмабласты и плазматические клетки. В то же время остается малоизученным вопрос о том, какие цитокины продуцируют сами В-лимфоциты и их субпопуляции.

Цель исследования - определить цитокиновый профиль В-лимфоцитов человека при стимуляции in vitro. В задачи исследования также входило сравнительное изучение спектра цитокинов, секретируемых наивными В-лимфоцитами, а также В-клетками памяти с переключенным и непереключенным синтезом Ig.

Материал и методы. Субпопуляции наивных В-лимфоцитов, а также В-клеток памяти с переключенным (IgG⁺CD27⁺) и непереключенным (IgM⁺CD27⁺) синтезом Ig выделяли с помощью проточного сортировщика клеток. Выделенные В-лимфоциты стимулировали in vitro в присутствии экзогенного ИЛ-21 и фидерных клеток, несущих молекулу CD40L. Супернатанты, собранные от стимулированных В-клеток, анализировали на наличие цитокинов. Исследование носило скрининговый характер. Чтобы охватить максимально широкую панель цитокинов, в работе использовался высокопроизводительный метод мультиплексного анализа. В тестируемую панель входили следующие цитокины: ЭФР, эотаксин, Г-КСФ, ГМ-КСФ, ИФН-α2, ИФН-γ, ИЛ-10, ИЛ-12P40, ИЛ-12P70, ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-17A, ИЛ-1RA, ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, ФНОα, ФНОβ, VEGF, ФРФ-2, ТФРα, Flt-3L, фракталкин, GRO, MCP-3, MDC, PDGF-AA, PDGF-AB/BB и ИЛ-9.

Результаты. Были получены и функционально охарактеризованы 3 субпопуляции стимулированных В-лимфоцитов: наивные В-лимфоциты, В-клетки памяти с переключенным (IgG⁺CD27⁺) и непереключенным (IgM⁺CD27⁺) синтезом Ig. Стимулированные В-лимфоциты характеризовались активной пролиферацией, приобретали фенотип плазмабластов и секретировали Ig. В-лимфоциты, стимулированные in vitro в системе ИЛ-21/CD40L, продуцировали широкий спектр цитокинов. В наибольшей степени секретировались IP-10, MDC и MCP-1. Секреция ИЛ-17A, ИЛ-12P70, ТФРα, ИФН-γ, ИЛ-3, ИЛ-5 и ИЛ-1β была ниже уровня детекции. Наивные В-клетки секретировали цитокины ИЛ-10, MCP-3, MDC, ИЛ-1α, MCP-1, ФНОα и ФНОβ более активно, чем В-клетки памяти. Для цитокинов ИЛ-10, MDC, MCP-1, ФНОα и ФНОβ значимая разница прослеживалась в отношении обеих субпопуляций В-клеток памяти. Для MCP-3 значимая разница наблюдалась только в отношении В-клеток памяти с переключенным синтезом Ig, а для ИЛ-1α - только по сравнению с В-клетками памяти с непереключенным синтезом Ig.

Заключение. Определены цитокиновые профили активированных В-лимфоцитов и их субпопуляций. Полученные результаты показывают, что продукция цитокинов В-клетками в значительной степени зависит от активации и дифференцировки В-лимфоцитов.

Введение. Воспаление верхних дыхательных путей развивается при таких патологиях, как аллергический ринит (АР), полипозный риносинусит (ПРС) и прочих. АР - одно из самых распространенных воспалительных заболеваний. Его патогенез включает увеличение продукции аллерген-специфических IgE-антител, инфильтрацию слизистой оболочки носовой полости воспалительными клетками и ремоделирование респираторного тракта. Показано, что при этой патологии ключевую роль играют Th2-цитокины (ИЛ-4 и ИЛ-13), что делает их многообещающими мишенями для терапии. Несколько препаратов на основе моноклональных антител против указанных цитокинов продемонстрировали клиническую эффективность, но их применение ограничено высокой стоимостью. В настоящее время появляются новые технологии регуляции экспрессии генов. Например, при помощи молекул малых интерферирующих РНК (миРНК) можно подавить экспрессию генов, кодирующих провоспалительные цитокины.

Цель работы - создание молекул миРНК, подавляющих экспрессию генов Il4 и Il13, а также исследование их биологического эффекта на модели воспаления верхних дыхательных путей у мышей.

Материал и методы. Проектирование молекул миРНК осуществляли с использованием специализированного программного обеспечения. Скрининг биологической активности миРНК проводили в экспериментах in vitro. Продукцию ИЛ-4 и ИЛ-13 оценивали с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), а экспрессию соответствующих генов - с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Индукцию воспаления верхних дыхательных путей у мышей осуществляли путем подкожного и интраназального введения аллергена - овальбумина куриного яйца (OVA). Экспериментальную терапию осуществляли путем интраназального введения молекул миРНК в комплексе с пептидом-носителем LTP. В качестве положительного контроля использовался кортикостероидный препарат будесонид. В ходе эксперимента у животных определяли назальную гиперреактивность. Уровень аллерген-специфических IgE-, IgG1- и IgG2a-антител в сыворотках крови, а также уровни продукции цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-13 клетками подчелюстных лимфоузлов определяли при помощи ИФА. Инфильтрацию слизистой оболочки носовой полости провоспалительными клетками оценивали гистологическими методами.

Результаты. Интраназальное введение миРНК против генов, кодирующих ИЛ-4 и ИЛ-13, снижало продукцию этих цитокинов в локальных (подчелюстных) лимфатических узлах. Подавление продукции ИЛ-4 и ИЛ-13 приводило к снижению уровней аллерген-специфических IgE- и IgG1-антител в сыворотке крови мышей и назальной гиперреактивности, а также к уменьшению воспаления и ремоделирования верхних дыхательных путей.

Заключение. Экспериментальная терапия молекулами миРНК, подавляющими продукцию провоспалительных цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-13, заметно облегчала симптомы аллергического воспаления верхних дыхательных путей. Синтетические миРНК обладают значительным потенциалом в терапии воспалительных заболеваний.

Введение. Преэклампсия (ПЭ) характеризуется избыточной и прогрессирующей активацией иммунной системы на фоне повышения уровня провоспалительных цитокинов и антиангиогенных факторов в плаценте, а также в эндотелии сосудов у беременных. При этом основное внимание исследователи уделяют патологии плаценты, в то время как состояние миометрия при этой патологии остается неясным. Паттерн-распознающие рецепторы (ПРР): Toll-подобные (TLRs), NOD-подобные (NLRs), RIG-подобные (RLRs), а также DAI (Z-DNA-binding protein 1, ZBP-1) - играют важную роль во врожденном иммунитете и экспрессируются не только в иммунных, но и в неиммунных клетках. Предполагается, что некоторые клинические проявления ПЭ вызваны основными общими воспалительными механизмами, регулируемыми ПРР.

Цель исследования - оценить уровень экспрессии ПРР (TLR8, NOD-1, RIG-1 и ZBP-1) в миоцитах, эндотелии и в фибробластоподобных клетках (ФБК) стенки матки при ПЭ и неосложненной беременности.

Материал и методы. Исследование выполнено на образцах миометрия, полученных во время кесарева сечения (КС) с передней стенки матки 22 женщин репродуктивного возраста (18-43 лет), на сроке гестации 27-39 нед, причем у 12 пациенток диагностировали ПЭ (6 пациенток с тяжелым течением ПЭ, 6 - с умеренным). Группу сравнения составили 10 женщин с неосложненной доношенной беременностью. На серийных срезах образцов ткани матки было выполнено иммуногистохимическое (ИГХ) исследование с применением поликлональных антител к NOD-1, TLR8, ZBP-1 (DLM/DAI), RIG-1.

Результаты. В результате исследования у пациенток с неосложненной беременностью выявили однородную экспрессию всех исследуемых ПРР в гладкомышечных клетках, эндотелии сосудов и ФБК. При ПЭ обнаружили выраженную неравномерность окрашивания миометрия. При умеренной ПЭ отмечали усиление экспрессии ZBP-1 в ФБК и эндотелии, NOD-1 в эндотелии относительно группы сравнения. Тяжелая ПЭ, в свою очередь, в отличие от умеренной, характеризовалась низкой экспрессией RIG-1 в эндотелии и ФБК, пониженной экспрессией NOD1 и усилением экспрессии TLR8 в эндотелии сосудов.

Заключение. При ПЭ значительно меняются ИГХ особенности экспрессии рецепторов врожденного иммунитета в миометрии, что дает новое понимание патогенеза ПЭ.

Введение. Лепра - хроническое гранулематозное заболевание, вызываемое Mycobacterium leprae (M. leprae), поражающее производные эктодермы (в первую очередь периферические нервы и кожу), часто приводящее к инвалидизации. Важнейшим инструментом лабораторного контроля лепры является иммунодиагностика. С использованием биоинформатики и сравнительной геномики были идентифицированы и клонированы гены, кодирующие уникальные для возбудителя лепры и потенциально наиболее иммуногенные белки. Было сделано предположение, что рекомбинантные антигены-кандидаты, уникальные для M. leprae, такие как ML0050 и ML0576, могут служить мишенями для оценки специфического клеточного и гуморального иммунитета к M. leprae.

В данной работе мы поставили цель получить конъюгированные с БСА рекомбинантные антигены M. leprae ML0050, ML0576, слитый рекомбинантный белок ML0050-ML0576 и оценить их диагностический потенциал для серологической диагностики лепры при определении IgG-, IgM- и IgA-антител человека к данным антигенам.

Материал и методы. В работе использовали молекулярно-генетические и иммунобиохимические методы. Материалом для исследований послужили сыворотки крови больных лепрой и туберкулезом, а также сыворотки крови здоровых доноров. В работе суммарно определяли IgG-, IgM- и IgA-антитела человека против антигенов M. leprae.

Результаты. Полученные нами рекомбинантные антигены M. leprae ML0050 и ML0576 и слитый рекомбинантный белок ML0050-ML0576, конъюгированные с бычьим сывороточным альбумином, оценены при определении IgG-, IgM- и IgA-антител человека против антигенов M. leprae с помощью иммуноферментного и иммунохроматографического анализа с сыворотками крови от 15 больных лепрой, 25 больных туберкулезом и 30 здоровых доноров.

Заключение. Полученные результаты показали возможность использования полученных рекомбинантных белков в качестве антигенов для серологической диагностики лепры.

В обзоре представлен анализ современного состояния проблемы использования ингибиторов костимуляции для предупреждения реакции отторжения трансплантата. Показана роль костимулирующих молекул в развитии отторжения трансплантата, а также успехи применения блокаторов костимуляции на экспериментальных моделях (мышей, нечеловекообразных приматов) и в клинических исследованиях.

Изложенные данные свидетельствуют о новых подходах в лечении реакции отторжения трансплантата с использованием блокаторов костимуляции. К ним относятся ингибиторы взаимодействий CD80/CD86 - CD28, CD40 - CD154, ICOS - ICOS-L, OX40 - OX40L, 4-1BB - 4-1BBL и др.

Представляется перспективным использование трансплантации гемопоэтических стволовых клеток с блокаторами костимуляции - при их сочетанном применении можно достигнуть донорского химеризма с формированием трансплантационной толерантности. Это улучшит прогноз и качество жизни реципиентов аллотрансплантата, позволит полностью отменить иммуносупрессивную терапию.

Одним из проявлений иммуностарения является воспалительное старение (inflammaging), которое считается важным фактором риска заболеваемости и смертности среди пожилых людей. Важную роль в формировании хронического стерильного воспаления, которое лежит в основе возрастной патологии, отводят хронической активации паттерн-распознающих рецепторов системы врожденного иммунитета и их сигнальных путей прежде всего эндогенными лигандами. При связывании лигандов с соответствующим TLR происходит активация NF-κB-сигнального пути, который рассматривается в качестве ключевого пути развития воспалительного старения.

Стимуляция NLR приводит к образованию инфламмасомы, одной из функций которой является процессинг провоспалительных цитокинов до биологически активной формы, что также считается важным фактором воспалительного старения и лежит в основе патогенеза различных хронических заболеваний.

В обзоре рассматривается роль инфламмасомного комплекса в иммунопатогенезе основных возраст-ассоциированных заболеваний: болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, сахарного диабета 2-го типа, атеросклероза, заболеваний суставов.

Показано, что ведущую роль в развитии возраст-ассоциированных заболеваний играет NLRP3-инфламмасома. Представлены данные, свидетельствующие о вкладе других типов инфламмасом в развитие возрастной патологии. Дальнейшее изучение механизмов воспалительного старения, опосредованных инфламмасомным комплексом, позволит выявить потенциальные мишени для терапии возраст-ассоциированных заболеваний.

Ревматоидный артрит (РА) представляет собой системное аутоиммунное заболевание, тесно связанное с пролиферацией синовиальной ткани, образованием паннуса в мелких суставах, таких как суставы кисти, запястья и стопы, разрушением хряща и системными осложнениями, такими как легочные, сердечно-сосудистые, неврологические и скелетно-мышечные поражения, глюкокортикоид-индуцированный остеопороз и инфекции. Важное значение для подтверждения диагноза и определения местной активности придается исследованию синовиальной жидкости. В настоящее время достигнуто глубокое понимание патологического процесса в суставе при РА, характеризующееся изменением аутореактивных CD4⁺-Т- и В-клеток, макрофагов, воспалительных цитокинов, хемокинов и аутоантител, хотя многое еще предстоит изучить. В этой статье представлен обновленный обзор патогенеза РА, открывающий еще больше терапевтических мишеней для воздействия на внутрисуставной патологический процесс.