Биологические эффекты новой изоформы ИЛ-5 в экспериментах in vitro

• Шиловский Игорь Петрович
• Ковчина Валерия Ивановна
• Тимотиевич Екатерина Драгановна
• Русак Татьяна Евгеньевна
• Смирнов Валерий Валерьевич
• Кудлай Дмитрий Анатольевич
• Хаитов Муса Рахимович

Резюме

Введение. Недавно был идентифицирован альтернативный вариант ИЛ-5 (ИЛ-5d2). Полноразмерный ИЛ-5 играет большое значение в созревании, активации и миграции провоспалительных клеток эозинофилов, в то же время биологическая роль сплайс-варианта ИЛ-5d2 неизвестна. Таким образом, цель данной работы - исследование биологических эффектов новой изоформы ИЛ-5d2 в экспериментах in vitro.

Материал и методы. Полноразмерный ИЛ-5 и его новая изоформа ИЛ-5d2 были наработаны в клетках HEK293T путем их трансфекции плазмидами, несущими соответствующие гены. Концентрацию ИЛ-5 и ИЛ-5d2 определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих моно- и поликлональных антител. Эозинофилы были получены путем дифференцировки клеток костного мозга мышей линии BALB/c в присутствии гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), факторов роста ИЛ-3 и ИЛ-5 или ИЛ-5d2. Из суспензии клеток готовили цитопрепараты с последующим дифференциальным окрашиванием азуром и эозином и подсчетом доли эозинофилов с помощью световой микроскопии.

Результаты и обсуждение. Лучше всего дифференцировка эозинофилов происходила в присутствии всех 3 факторов (ГМ-КСФ, ИЛ-3 и ИЛ-5). Замена полноразмерного ИЛ-5 на его сплайс-вариант приводила к замедлению дифференцировки эозинофилов из клеток костного мозга мыши. Следует отметить, что за одинаковый промежуток времени (5 сут) содержание эозинофилов в присутствии сплайс-варианта ИЛ-5d2 мыши уменьшалось на 25 % по сравнению с полноразмерной формой ИЛ-5 мыши. Таким образом, биологическая активность сплайс-варианта ИЛ-5d2 мыши ниже по сравнению с полноразмерным ИЛ-5 мыши. Дополнительные эксперименты продемонстрировали, что дифференцировка эозинофилов может происходить лишь при инкубации с ИЛ-5 в отсутствие ГМ-КСФ и ИЛ-3. ИЛ-5d2 также способствовал дифференцировке эозинофилов. Далее, была изучена способность ИЛ-5d2 конкурентно ингибировать ИЛ-5-зависимую дифференцировку эозинофилов. В результате было показано, что ИЛ-5d2 не выступает в качестве ингибитора активности полноразмерного ИЛ-5 мыши.

Заключение. Таким образом, ИЛ-5d2 обладает собственной биологической активностью, сходной с полноразмерным цитокином. Кроме того, ИЛ-5d2 не ингибирует активность ИЛ-5.

Ключевые слова: бронхиальная астма; Th2-цитокины; альтернативный сплайсинг; альтернативный вариант ИЛ-5; интерлейкин-5

Введение

Бронхиальная астма (БА) - гетерогенное заболевание, обычно характеризующееся хроническим воспалением дыхательных путей [1-3]. В отдельных странах заболеваемость достигает 15-18 % [4], в России - ~ 7 % населения [5]. Рост распространенности БА, по всей видимости, связан с ограниченной эффективностью существующих способов терапии. В то же время невозможно создать новые методы лечения, не раскрыв молекулярные и клеточные механизмы патогенеза этого заболевания.

В течение последних трех десятилетий были получены убедительные доказательства роли T-хелперов типа 2 (Th2) и продуцируемых ими цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-13) в формировании проявлений БА [6, 7]. Именно данные цитокины обеспечивают продукцию специфических IgE-антител, развитие гиперреактивности бронхов, инфильтрацию дыхательных путей провоспалительными клетками (главным образом эозинофилами).

Поскольку гены Th2-цитокинов содержат несколько экзонов, возможно существование альтернативных мРНК-транскриптов и изоформ белков. Для некоторых Th2-цитокинов (ИЛ-4 и ИЛ-5) ранее были идентифицированы альтернативные мРНК-транскрипты и альтернативные изоформы белка, которые наравне с полноразмерными вариантами могут участвовать в патогенезе, например, аллергической БА [8]. Так, для ИЛ-4 человека была выявлена альтернативная форма белка ИЛ-4d2 (с делецией экзона 2), которая, как оказалось, конкурирует с полноразмерной формой за общие рецепторы и является антагонистом полноразмерной формы ИЛ-4 [9].

Способность ИЛ-4d2 негативно регулировать Th2-иммунный ответ подтверждается экспериментами in vivo, так как введение животным ИЛ-4d2 активировало продукцию ИФН-γ - антагониста ИЛ-4. Примечательно, что в ответ на введение ИЛ-4d2 в дыхательные пути мышей развивалось незначительное воспаление, выражавшееся в накоплении Т- и В-лимфоцитов в легких. В то же время введение ИЛ-4 провоцировало более выраженное воспаление, характеризующееся инфильтрацией не только Т- и В-лимфоцитами, но и эозинофилами, а также гиперплазией бокаловидных клеток респираторного эпителия [10]

Недавно нашим коллективом был идентифицирован альтернативный вариант ИЛ-5 (ИЛ-5d2) [11]. При анализе продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) было показано, что новая форма мРНК ИЛ-5d2 экспрессируется вместе с канонической формой в различных активированных лимфоидных тканях мыши: тимусе, селезенке, лимфоузлах и в клетках крови. Новая изоформа ИЛ-5d2 образуется в результате альтернативного сплайсинга из пре-мРНК путем делеции самого короткого экзона 2 и включения в зрелый транскрипт экзонов 1, 3 и 4. ИЛ-5d2 имеет значительное структурное сходство с ранее идентифицированной изоформой ИЛ-4d2 которая в результате альтернативного сплайсинга из четырех экзонов тоже утрачивает самый короткий экзон 2 [12].

Изоформа ИЛ-4d2 была идентифицирована значительно ранее, чем ИЛ-5d2, поэтому ее биологические эффекты изучены лучше. Согласно текущим представлениям, ИЛ-4d2 является отрицательным регулятором активности полноразмерной формы ИЛ-4, в частности нивелирует избыточный Th2-иммунный ответ при БА [13,14]. Учитывая значительное сходство ИЛ-4d2 и ИЛ-5d2, можно полагать, что ИЛ-5d2 тоже может играть определенную роль в патогенезе аллергических заболеваний, например при БА негативно регулировать активность полноразмерного ИЛ-5 и снижать избыточное эозинофильное воспаление в легких.

Таким образом, главной целью данной работы является исследование биологических эффектов новой изоформы ИЛ-5d2 в экспериментах in vitro.

В задачи исследования входило исследование биологических эффектов новой изоформы ИЛ-5d2 по сравнению с полноразмерным вариантом ИЛ-5 и сравнение активности новой изоформы ИЛ-5d2 и полноразмерного варианта ИЛ-5 индуцировать дифференцировку эозинофилов мыши.

Материал и методы

Плазмиды, кодирующие ИЛ-5 и ИЛ-5d2 мыши, питательные среды, культуры клеток и факторы роста. Плазмиды pCMV-mIL5 и pCMV-mIL5d2, кодирующие соответствующие белки ИЛ-5 и ИЛ-5d2 мыши, были сконструированы ранее и описаны в работе [10]. В работе использовали питательную среду IMDM ("ПанЭко", Россия) с добавлением 25 мМ HEPES ("ПанЭко", Россия), 300 мг/л L-глутамина ("ПанЭко", Россия), 50 мкг/мл гентамицина (Gibco, США). Для получения полной питательной среды к вышеуказанному составу добавляли 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Biosera, Филиппины). В работе использовали клеточную линию HEK293Т (почка эмбриона человека), приобретенную в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России. В работе использовали гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и ИЛ-3 (оба - PeproTech, Англия).

Лабораторные животные. В исследовании были использованы мыши-самки линии BALB/с возрастом 6-8 нед, массой тела 18-20 г, полученные из питомника лабораторных животных филиала ФГБУН "Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова" РАН, Минобрнауки России (г. Пущино, Россия). Животных кормили стандартизированным кормом для грызунов ("Дельта Фидс", Россия), им был предоставлен неограниченный доступ к еде и воде. Животных содержали в системе индивидуально вентилируемых клеток Smart Flow (TECHIPLAST, Италия). Вся работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с принципами Директивы Европейского Союза 2010/63/EU "Законодательство о защите животных, используемых в научных целях" и Российскими нормативными документами (ГОСТ 33216-2014 "Правила работы с лабораторными грызунами и кроликами" и ГОСТ 34088-2017 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за сельскохозяйственными животными") и была одобрена локальным этическим комитетом (Протокол № 10 от 23.04.2018).

Наработка ИЛ-5 и ИЛ-5d2 в культуре клеток HEK293T. Полноразмерный ИЛ-5 и его новая изоформа ИЛ-5d2 ранее были клонированы нами в экспрессионные плазмиды под контролем CMV-промотора. Используя эти плазмиды, мы провели наработку белков ИЛ-5 и ИЛ-5d2 в клетках HEK293T. Для этого в чашки Петри засевали 5 млн клеток в объеме 10 мл полной среды DМЕМ (10 % ЭТС, 300 мг/л L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина, 25 мМ HEPES). Клетки были трансфецированы смесью, состоящей из 5 мкг плазмид pCMV-mIL5 или pCMV-mIL5d2 и коммерческого реагента Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, США), в соответствии с рекомендациями производителя. Через 4 ч среду заменяли на бессывороточную, а через 48 ч после трансфекции собирали супернатанты клеток, в которых содержался ИЛ-5 или ИЛ-5d2, и замораживали при температуре -20 °С. В качестве отрицательного контроля собирали бессывороточную среду от нетрансфецированных клеток.

Определение концентрации ИЛ-5 и ИЛ-5d2 в супернатантах клеток методом иммуноферментного анализа. Концентрацию ИЛ-5 и ИЛ-5d2 в супернатантах клеток определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческого набора (BD Biosciences, США), содержащего моноклональные антитела к ИЛ-5. Для детекции ИЛ-5d2 дополнительно применяли метод прямого ИФА с поликлональными антителами (eBioscience, США) в соответствии с рекомендациями производителя.

Получение клеток костного мозга мышей. Для получения костного мозга проводили некропсию мышей линии BALB/c, после чего содержимое костной трубки бедренной и большеберцовой костей несколько раз вымывали физиологическим раствором (0,9 % NaCl, "ПанЭко", Россия) в чашку Петри, используя инъекционный шприц. Полученную суспензию клеток пропускали через фильтр 70 мкм (SPL Life Sciences, Южная Корея). Фильтрат переносили в 50 мл пробирку и центрифугировали при следующих условиях: 300 g, 5 мин, комнатная температура. Далее удаляли супернатант, после чего осадок ресуспендировали в буфере для лизиса эритроцитов (Roche, Франция). После инкубации в течение 1 мин при комнатной температуре останавливали реакцию добавлением физиологического раствора (0,9 % NaCl, "ПанЭко", Россия) согласно инструкции производителя. Полученную суспензию клеток центрифугировали при следующих условиях: 300 g, 5 мин, комнатная температура. После удаления супернатанта клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл полной среды IMDM ("ПанЭко", Россия) и центрифугировали при условиях, описанных выше. Полученный осадок клеток ресуспендировали в необходимом количестве полной среды IMDM ("ПанЭко", Россия).

Количество клеток для засева в лунку планшета рассчитывали в зависимости от общей клеточности образца. Как правило, оно варьировало в зависимости от физиологических особенностей мыши. Для проведения экспериментов по дифференцировке эозинофилов из клеток костного мозга мыши добавляли следующие факторы: ГМ-КСФ (PeproTech, Англия), ИЛ-3 (PeproTech, Англия) и ИЛ-5 или ИЛ-5d2 либо среду, не содержащую факторы. Затем клетки инкубировали с указанными факторами в течение 2 нед, меняя среду каждые 3 сут. Концентрации факторов, необходимые для дифференцировки эозинофилов, варьировали в зависимости от задач в экспериментах.

Приготовление цитопрепаратов для определения доли эозинофилов. В контрольные дни эксперимента из клеток готовили цитопрепараты с последующим дифференциальным окрашиванием азуром и эозином. Гистологическое исследование цитопрепаратов осуществляли с помощью светового микроскопа (Olympus, Япония). Подсчет доли эозинофилов выполняли в количестве не менее 300 клеток (эозинофилы были идентифицированы по специфической окраске гранул и ядра) на один мазок при увеличении в 400 раз.

Статистический анализ данных. Для всех количественных данных вычисляли среднее арифметическое (М) и стандартную ошибку среднего (m). Определяли межгрупповые различия с помощью непараметрического метода Краскелла-Уоллиса с использованием программы Statistica 12.0 (StatSoft Inc., США).

Результаты

Продукция ИЛ-5 и ИЛ-5d2 мыши в клетках эукариот

Методом сэндвич-ИФА с использованием коммерческого набора моноклональных антител была измерена продукция ИЛ-5 и ИЛ-5d2 мыши клетками HEK293Т, трансфецированных плазмидами. Содержание ИЛ-5 в супернатантах варьировало в пределах от 1 до 3 мкг/мл (средняя концентрация - 2,1 ± 0,4 мкг/мл). В то же время ИЛ-5d2 в супернатантах клеток с использованием набора моноклональных антител не выявлялся (рис. 1). Это может быть связано с делецией экзона 2, которая приводит к изменению структуры эпитопов цитокина, и с неспособностью моноклональных антител взаимодействовать с ИЛ-5d2 в ходе проведения анализа.

Поскольку ИЛ-5d2 был идентифицирован относительно недавно, отсутствуют коммерческие моноклональные антитела, распознающие эту изоформу ИЛ-5. Поэтому мы провели дополнительный анализ уровня продукции ИЛ-5 и ИЛ-5d2 с использованием коммерческих поликлональных антител методом непрямого ИФА. Было показано, что ИЛ-5d2, как и полноразмерный ИЛ-5, обнаруживается в клеточных супернатантах в сопоставимых концентрациях (рис. 1). Учитывая это, мы полагаем, что концентрация ИЛ-5 и ИЛ-5d2 в клеточных супернатантах одинаковая составляет 2,1±0,4 мкг/мл.

Влияние новой изоформы ИЛ-5d2 на дифференцировку эозинофилов из клеток костного мозга мышей в присутствии факторов ГМ-КСФ и ИЛ-3

Для изучения влияния полноразмерного ИЛ-5 и его изоформы ИЛ-5d2 на дифференцировку эозинофилов клетки костного мозга мышей инкубировали в присутствии следующих факторов: ГМ-КСФ (20 нг/мл), ИЛ-3 (5 нг/мл), ИЛ-5 или ИЛ-5d2 (10 нг/мл). Применение вышеупомянутой комбинации факторов способствует дифференцировке эозинофилов из клеток костного мозга мыши, как указано в работе [15]. В контрольные дни эксперимента (0, 5, 9, 12), готовили цитопрепараты, окрашивали их азуром и эозином и подсчитывали число эозинофилов с помощью световой микроскопии.

Как и ожидалось, лучше всего дифференцировка эозинофилов происходила в присутствии всех 3 факторов (ГМ-КСФ, ИЛ-3 и ИЛ-5) - к 9-му дню эксперимента доля эозинофилов достигала 30 % и оставалась на этом уровне в финальный, 12-й, день эксперимента. Замена полноразмерного ИЛ-5 на его укороченную изоформу ИЛ-5d2 к 9-му дню приводила к статистически значимому уменьшению дифференцировки эозинофилов из клеток костного мозга на 25 % по сравнению с вариантом "ГМ-КСФ + ИЛ-3 + ИЛ-5": доля эозинофилов составляла 22 ± 6 против 30 ± 6 % (рис. 2).

В результате эксперимента было отмечено, что дифференцировка эозинофилов может происходить и в отсутствие ИЛ-5, достаточно только двух факторов: ГМ-КСФ + ИЛ-3. Однако в отсутствие ИЛ-5 продолжительность жизни эозинофилов существенно снижалась. На 12-й день эксперимента их содержание уменьшалось в 4,8 раза: 22 060 ± 13 596 кл/мл при культивировании с факторами ГМ-КСФ + ИЛ-3 против 126 519 ± 44 635 кл/мл при культивировании с факторами ГМ-КСФ + ИЛ-3 + ИЛ-5 (рис. 2). Эти данные подтверждают тот факт, что под влиянием полноразмерного ИЛ-5 выживаемость эозинофилов повышается.

Влияние ИЛ-5d2 на дифференцировку эозинофилов из клеток костного мозга мышей в отсутствие факторов ГМ-КСФ и ИЛ-3

Учитывая, что в отсутствие полноразмерной формы ИЛ-5, но при наличии двух факторов роста ГМ-КСФ и ИЛ-3 также образуются эозинофилы, мы провели дополнительные эксперименты, в которых оценили возможности ИЛ-5 и его изоформы индуцировать дифференцировку эозинофилов без дополнительных факторов.

Для проведения эксперимента клетки костного мозга инкубировали в присутствии различных концентраций (0,5; 1; 2 и 10 нг/мл) полноразмерного ИЛ-5 и его изоформы ИЛ-5d2. Длительность инкубации цитокинов с клетками мы оценивали на стадии предварительных экспериментов без использования дополнительных стимулирующих факторов, она составляла 5 дней. В финальный день эксперимента (день 5) готовили цитопрепараты с последующим окрашиванием азуром и эозином и подсчитывали число эозинофилов с помощью световой микроскопии (рис. 3).

После анализа полученных результатов было показано, что обе формы способствовали появлению эозинофилов на 5-й день инкубации. Однако полноразмерный ИЛ-5 оказывал более выраженный эффект на дифференцировку эозинофилов. После 5-дневной инкубации клеток костного мозга с ИЛ-5 в низких концентрациях (0,5 и 2 нг/мл) наблюдалось статистически значимо большее содержание эозинофилов, чем при инкубации с аналогичными концентрациями новой изоформы ИЛ-5d2. При концентрации ИЛ-5d2 0,5 нг/мл содержание эозинофилов составило 22 900 ± 6100 кл/мл против 6 872 ± 2500 кл/мл, при концентрации ИЛ-5d2 2 нг/мл содержание эозинофилов составило 60 600 ± 22 077 кл/мл против 18 334 ± 6264 кл/мл (рис. 3).

При высокой концентрации (10 нг/мл) и полноразмерная форма ИЛ-5, и изоформа ИЛ-5d2 в равной степени способствовали дифференцировке эозинофилов, содержание которых достигало 15 % (рис. 3). Эти данные свидетельствуют о том, что новая изоформа ИЛ-5d2 обладает собственной биологической активностью, сходной с полноразмерной формой цитокина, но менее выраженной.

Изучение способности ИЛ-5d2 ингибировать ИЛ-5-опосредованную дифференцировку эозинофилов

Согласно опубликованным ранее данным, описанная изоформа ИЛ-4d2 (утратившая экзон 2) может ингибировать активность полноразмерной формы ИЛ-4. В частности, ИЛ-4d2 ингибировал пролиферацию Т-клеток, индуцируемую полноразмерным ИЛ-4 [16] и уменьшал его продукцию Th2-клетками [10], блокировал эффекты ИЛ-4 в культуре моноцитов, а также ингибировал способность ИЛ-4 запускать синтез IgE B-клетками [16]. Учитывая эти факты, а также сходство с ИЛ-4d2, мы предположили, что изоформа ИЛ-5d2 также может выступать в качестве ингибитора активности полноразмерного ИЛ-5.

Для оценки способности новой изоформы ИЛ-5d2 ингибировать активность полноразмерного ИЛ-5 мы осуществляли дифференцировку эозинофилов из клеток костного мозга в присутствии 2 нг/мл ИЛ-5, а также в условиях предварительной обработки различными концентрациями ИЛ-5d2 (2 или 5 нг/мл) в течение 5 сут.

В результате в присутствии полноразмерного ИЛ-5 происходила дифференцировка эозинофилов (их доля составляла 9 ± 1 %), в то время как предварительное добавление к клеткам укороченной изоформы ИЛ-5d2 не приводило к ингибированию этого процесса. Наоборот, наблюдалось увеличение доли эозинофилов. При предварительной инкубации с 5 нг/мл ИЛ-5d2 с последующим добавлением 2 нг/мл ИЛ-5 доля эозинофилов возрастала с 9 ± 1 до 15 ± 3 % (рис. 4). Таким образом, укороченная изоформа ИЛ-5d2 не ингибирует активность полноразмерного ИЛ-5. Это также подтверждает наши предварительные данные о том, что ИЛ-5d2 обладает собственной биологической активностью, сходной с полноразмерным цитокином.

Обсуждение

В работе изучена биологическая активность новой сплайс-формы ИЛ-5 - ИЛ-5d2. Для этого с использованием рекомбинантных экспрессионных плазмид и эукариотических клеток HEK293Т была осуществлена их наработка в бессывороточных средах. Эти клетки были выбраны ввиду того, что их легко трансфецировать, они способны осуществлять продукцию и секрецию цитокинов во внеклеточное пространство (в культурную среду). После трансфекции плазмидами мы заменяли среду на бессывороточную для того, чтобы исключить биологические эффекты компонентов сыворотки. Известно, что при культивировании клетки HEK293Т способны продуцировать экзосомы и секретировать собственные факторы (цитокины, хемокины), которые также могут оказывать дополнительные биологические эффекты. Для их минимизации супернатанты, содержащие ИЛ-5 и ИЛ-5d2, пропускали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, а также в качестве отрицательного контроля использовали супернатанты клеток, которые не были транфецированы плазмидами. В результате была получена бессывороточная среда, содержащая 2,1 ± 0,4 мкг/мл ИЛ-5. Концентрация полноразмерного ИЛ-5 была определена с помощью коммерческого набора моноклональных антител. Этот коммерческий набор также содержал стандарт этого цитокина, что позволило построить калибровочную кривую и определить концентрацию ИЛ-5, наработанного в клетках HEK293Т. Коммерческий набор, содержащий моноклональные антитела, не позволил осуществить количественную детекцию ИЛ-5d2. По всей видимости, делеция экзона 2 меняет структуру эпитопов этого цитокина. Для определения новой изоформы ИЛ-5d2 отсутствуют коммерческие наборы, способные ее селективно и количественно детектировать, поэтому мы использовали метод непрямого ИФА с коммерческими поликлональными антителами. Было показано, что ИЛ-5d2, как и полноразмерный ИЛ-5, обнаруживается в клеточных супернатантах в сопоставимых количествах (см. рис. 1). Учитывая это, мы полагаем, что концентрация ИЛ-5 и ИЛ-5d2 в клеточных супернатантах сопоставима и составляет 2,1 ± 0,4 мкг/мл.

Изоформа ИЛ-4, известная как ИЛ-4d2, образуется в результате альтернативного сплайсинга мРНК. Она характеризуется удалением самого короткого экзона 2 и включением в зрелый транскрипт экзонов 1, 3 и 4. ИЛ-4d2 обладает способностью снижать активность полноразмерной формы ИЛ-4, что позволяет ей контролировать Th2-иммунный ответ и воспалительные процессы, связанные с аллергическими заболеваниями, в том числе БА.

Учитывая значительное структурное сходство между сплайс-формами ИЛ-4d2 и ИЛ-5d2, можно предположить, что ИЛ-5d2 также может участвовать в патогенезе аллергических заболеваний, подавляя активность полноразмерного ИЛ-5 и снижая чрезмерное эозинофильное воспаление в легких.

Поскольку известно, что ИЛ-5 является ростовым и дифференцировочным фактором для эозинофилов [15], нами было проведено сравнительное исследование влияния ИЛ-5 и ИЛ-5d2 на процесс дифференцировки эозинофилов. Для этого клетки костного мозга мышей линии BALB/с культивировали в среде, содержащей оптимальные концентрации основных дифференцировочных факторов (ГМ-КСФ, ИЛ-3, ИЛ-5 или его изоформы ИЛ-5d2). В результате замена полноразмерного ИЛ-5 на его сплайс-вариант приводила к снижению эффективности дифференцировки эозинофилов из клеток костного мозга на 25 %. Таким образом, биологическая активность сплайс-варианта ИЛ-5d2 ниже по сравнению с полноразмерным ИЛ-5.

В дополнительных экспериментах удалось добиться дифференцировки эозинофилов из клеток костного мозга в присутствии только ИЛ-5 (т. е. без добавления ГМ-КСФ, ИЛ-3 в культурную среду). Однако в этом случае пик дифференцировки наступал раньше (на 5-е сутки вместо 12-х), а доля эозинофилов была ниже, чем при использовании всех 3 факторов.

Укороченная изоформа ИЛ-5d2 также способствовала дифференцировке эозинофилов в отсутствии ГМ-КСФ и ИЛ-3, но она была менее выражена в сравнении с ИЛ-5. Только повышение концентрации ИЛ-5d2 (≥ 10 нг/мл) обеспечивало дифференцировку на уровне, сравнимом с полноразмерной формой ИЛ-5. Эти данные могут свидетельствовать о том, что утрата экзона 2, кодирующего 11 а. о., не привела к утрате способности новой изоформы взаимодействовать с рецептором и запускать биологические эффекты, характерные для ИЛ-5. Однако, вероятно, из-за структурных отличий от ИЛ-5, новая изоформа ИЛ-5d2 обладает более низкой аффинностью к рецепторам на клеточной поверхности, что приводит к уменьшению эффективности передачи сигналов и, следовательно, к снижению процесса дифференциации эозинофилов.

По аналогии с ИЛ-4d2 [16] мы предположили, что новая изоформа ИЛ-5d2 может конкурентно ингибировать активность полноразмерного ИЛ-5. Для этого мы осуществляли дифференцировку эозинофилов из клеток костного мозга мыши в присутствии ИЛ-5, а также в условиях предварительной обработки различными концентрациями ИЛ-5d2. В результате укороченная изоформа ИЛ-5d2 не ингибировала процесс дифференцировки эозинофилов.

Полученные данные свидетельствует о том, что ИЛ-5d2 обладает собственной биологической активностью, схожей с таковой полноразмерного цитокина ИЛ-5, хотя и менее выраженной. Можно предположить, что биологическая функция укороченной изоформы может состоять в регуляции избыточного воспаления, опосредованного эозинофилами. Вероятно, при чрезмерном воспалении происходит переключение синтеза с ИЛ-5 на ИЛ-5d2 по механизму альтернативного сплайсинга, что снижает (а не полностью предотвращает) дифференцировку и выживаемость эозинофилов. Однако это предположение требует экспериментальной проверки, прежде всего в экспериментах на лабораторных животных, для которых также необходимы дополнительные реагенты (например, моноклональные антитела и специфические праймеры для ПЦР), позволяющее специфически выявлять полноразмерную и укороченную формы ИЛ-5.

Заключение

Таким образом, ИЛ-5d2 обладает собственной биологической активностью, сходной с активностью полноразмерного цитокина. Кроме того, ИЛ-5d2 не ингибирует активность ИЛ-5.

Литература

1. Никольский А.А., Шиловский И.П., Ковчина В.И. Модель нейтрофильной бронхиальной астмы у мышей как инструмент для тестирования персонализированных лекарственных средств. Биотехнология. 2020; 36 (4): 80-6. DOI: https://doi.org/10.21519/0234-2758-2020-36-4-80-86

2. Никольский А.А., Шиловский И.П., Юмашев К.В., Вишнякова Л.И., Барвинская Е.Д., Ковчина В. И., Корнеев А.В., Туренко В.Н., Каганова М.М., Брылина В.Е., Никонова А.А., Козлов И.Б., Кофиади И.А., Сергеев И.В., Маерле А.В., Петухова О.А., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Влияние локального подавления экспрессии гена Stat3 на нейтрофильное воспаление легких в экспериментальной модели на мышах. Иммунология. 2021; 42 (6): 600-14. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-600-614

3.  Бабахин А.А., Ласкин А.А., Никонова А.А., Камышников О.Ю., Царев С.В., Шиловский И.П., Маркина А.А., Апарин П.Г., Вонг Х., Хаитов М.Р. Моделирование бронхиальной астмы с нейтрофильным фенотипом воспаления. Иммунология. 2017; 38 (4): 199-205. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-4-199-205

4.  Soriano J.B., Abajobir A.A., Abate K.H., Abera S.F., Agrawal A., Ahmed M.B., Aichour A.N., Aichour I., Eddine Aichour M.T., Alam K., Alam N., Alkaabi J.M., Al-Maskari F., Alvis-Guzman N., Amberbir A., Amoako Y.A., Ansha M.G., Antó J.M., Asayesh H., Atey T.M., Avokpaho E.F.G.A., Barac A., Basu S., Bedi N., Bensenor I.M., Berhane A., Beyene A.S., Bhutta Z.A., Biryukov S., Boneya D.J., Brauer M., Carpenter D.O., Casey D., Christopher D.J., Dandona L., Dandona R., Dharmaratne S.D., Do H.P., Fischer F., Gebrehiwot T.T., Geleto A., Ghoshal A.G., Gillum R.F., Mohamed Ginawi I.A., Gupta V., Hay S.I., Hedayati M.T., Horita N., Hosgood H.D., Jakovljevic M.M.B., James S.L., Jonas J.B., Kasaeian A., Khader Y. S., Khalil I.A., Khan E.A., Khang Y.H., Khubchandani J., Knibbs L.D., Kosen S., Koul P.A., Kumar G.A., Leshargie C.T., Liang X., Magdy Abd El Razek H., Majeed A., Malta D.C., Manhertz T., Marquez N., Mehari A., Mensah G.A., Miller T.R., Mohammad K.A., Mohammed K.E., Mohammed S., Mokdad A.H., Naghavi M., Nguyen C.T., Nguyen G., Nguyen Q Le., Nguyen T.H., Ningrum D.N.A., Nong V.M, Obi J.I., Odeyemi Y.E., Ogbo F.A., Oren E., Mahesh P.A., Park E.K., Patton G.C., Paulson K., Qorbani M., Quansah R., Rafay A., Rahman M.H.U., Rai R.K., Rawaf S., Reinig N., Safiri S., Sarmiento-Suarez R., Sartorius B., Savic M., Sawhney M., Shigematsu M., Smith M., Tadese F., Thurston G.D., Topor-Madry R., Tran B.X., Ukwaja K.N., van Boven J.F.M., Vlassov V.V., Vollset S.E., Wan X, Werdecker A, Hanson S.W., Yano Y., Yimam H.H., Yonemoto N., Yu C., Zaidi Z., Sayed Zaki M.El., Lopez A.D., Murray C.J.L., Vos T. Global, regional, and national deaths, prevalence, disability-adjusted life years, and years lived with disability for chronic obstructive pulmonary disease and asthma, 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet Respir. Med. 2017; 9 (5): 691-706. DOI: https://doi.org/10.1016/S2213-2600(17)30293-X

5.  Авдеев С.Н., Ненашева Н.М., Жуденков К.В., Петраковская В.А., Изюмова Г.В. Распространенность, заболеваемость, фенотипы и другие характеристики тяжелой бронхиальной астмы в Российской Федерации. Пульмонология. 2018; 28 (3): 341-58. DOI: https://doi.org/10.18093/0869-0189-2018-28-3-341-358

6.  Bush A. Pathophysiological Mechanisms of Asthma. Front. Pediatr. 2019; 68 (7): 1-17. DOI: https://doi.org/10.3389/FPED.2019.00068

7.  Kuruvilla M.E., Lee F.E.H., Lee G.B. Understanding Asthma Phenotypes, Endotypes, and Mechanisms of Disease. Clin. Rev. Allergy Immunol. 2019; 56 (2): 219-33. DOI: https://doi.org/10.1007/S12016-018-8712-1

8.  Шиловский И.П., Ковчина В.И., Тимотиевич Е.Д., Никольский А.А. Роль и молекулярные механизмы альтернативного сплайсинга Th2-цитокинов IL-4 и IL-5 в аллергической бронхиальной астме. Биохимия. 2023; 88 (10): 1940-56. DOI: http://doi.org/10.1134/S0006297923100152

9.  Klein S.C., Golverdingen J.G., Bouwens A. G.M., Tilanus M.G.J., de Weger R.A. An alternatively spliced interleukin 4 form in lymphoid cells. Immunogenetics. 1995; 41 (1): 57. DOI: https://doi.org/10.1007/BF00188440

10. Luzina I.G., Lockatell V., Lavania S., Pickering E.M., Kang P.H., Bashkatova Y.N., Andreev S.M., Atamas S.P. Natural production and functional effects of alternatively spliced interleukin-4 protein in asthma. Cytokine. 2012; 58 (1): 20-6. DOI: https://doi.org/10.1016/J.CYTO.2011.12.017

11. Шиловский И.П., Никольский А.А., Курбачева О.М., Хаитов М.Р. Современные представления о молекулярных механизмах нейтрофильной бронхиальной астмы и ее терапии. Биохимия. 2020; 85 (8): 854-68. DOI: http://doi.org/10.1134/S0006297920080027

12. Alms W.J., Atamas S.P., Yurovsky V.V., White B. Generation of a variant of human interleukin-4 by alternative splicing. Mol. Immunol. 1996; 33 (4-5): 361-70. DOI: https://doi.org/10.1016/0161-5890(95)00154-9

13. Glare E.M., Divjak M., Rolland J.M., Walters E.H. Asthmatic airway biopsy specimens are more likely to express the IL-4 alternative splice variant IL-4delta2. J. Allergy Clin. Immunol. 1999; 104 (5): 978-82. DOI: https://doi.org/10.1016/S0091-6749(99)70078-3

14. Seah G.T., Gao P.S., Hopkin J.M., Rook G.A.W. Interleukin-4 and its alternatively spliced variant (IL-4delta2) in patients with atopic asthma. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2001; 164 (6): 1016-8. DOI: https://doi.org/10.1164/AJRCCM.164.6.2012138

15. Reichman H., Rozenberg P., Munitz A. Mouse Eosinophils: Identification, Isolation, and Functional Analysis. Curr. Protoc. Immunol. 2017; 119: 14.43.1-14.43.22. DOI: https://doi.org/10.1002/CPIM.35

16. Atamas S.P., Choi J., Yurovsky V.V., White B. An alternative splice variant of human IL-4, IL-4 delta 2, inhibits IL-4-stimulated T cell proliferation. J. Immunol. 1996; 156 (2): 435-41. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.156.2.435

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)